干细胞治疗宫腔粘连及薄型子宫内膜的研究进展

郭杉，刘英

随着辅助生殖技术的日趋成熟，越来越多的不孕不育患者可以接受规范治疗后成功受孕。但是，通过辅助生殖技术助孕的患者每一周期的临床分娩率仅为30%，且近年趋于稳定[1]。影响辅助生殖技术成功率的一个重要因素是不孕不育患者的子宫内膜状态。子宫内膜损伤及子宫内膜炎症均可造成宫腔状态异常，进而导致宫腔粘连（intrauterine adhesion，IUA）及子宫内膜薄等病症[2]。

IUA是女性继发性不孕的主要病因之一[3]。对于IUA患者，目前临床上采取的治疗手段主要为宫腔镜手术治疗，然而通过手术分离粘连、出血和穿孔风险大，术后复发率高，可能导致患者内膜再次损伤[4]。临床上子宫内膜过薄（＜7 mm）的患者，移植的胚胎难以植入[5]。虽然临床应用诸多种类的药物如芬吗通、阿司匹林、西地那非等，以改善患者子宫内膜的厚度和血流量，进而提高胚胎移植后的临床妊娠率，但效果甚微[6]。

干细胞疗法是21世纪的热点研究领域，为这类患者带来了希望。已有许多种类的干细胞被证实与子宫内膜更新再生相关，可被应用于子宫内膜损伤修复，如骨髓源性干细胞（bone marrow-derived stem cells，BMDSCs）[7]、 脐 带 间 充 质 干 细 胞（human umbilicalcord -derived mesenchymal stemcells，UC -MSCs）[8]、经血干细胞 （menstrual blood-derived stromal cells，menSCs）[9]、 脂 肪 间 充 质 干 细 胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）[10]、人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）等[11]。本文将从细胞实验、动物实验及临床试验三方面，对干细胞治疗IUA及薄型子宫内膜的研究进展进行综述。

1 细胞实验

1.1 胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs） 分离于人囊胚内细胞团的hESCs，具有全能性，可向内、中、外3个胚层方向分化[12]。已有研究表明，在适宜条件下hESCs可被诱导分化为心肌细胞[13]、视网膜上皮细胞[14]、肝细胞样细胞[15]、胰岛素分泌细胞[16]和神经前体细胞[17]等。

有学者曾将其生殖中心自主建系的hESCs向子宫内膜细胞进行诱导分化，采用共培养、细胞因子以及拟胚体悬浮分化3种方法对在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast cell，MEF）饲养层上培养的hESCs进行分化。在共培养组中，使用膜嵌套（transwell）共培养系统，将子宫内膜间质细胞与hESCs进行共培养，分化培养基为含有β雌二醇（β-E2）、转化生长因子α（TGF-α）、表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）及10%血清的DMEM/F12培养液；在细胞因子组中，hESCs于MEF上培养4 d后，将培养基更换为含有β-E2、TGF-α、EGF、PDGF-BB及10%血清的分化培养基；在拟胚体分化组中，将hESCs种在饲养层细胞上培养4 d后，机械法将克隆切下，放入低吸附培养皿中，加入拟胚体悬浮培养基。5 d后，将拟胚体转入经0.1%明胶铺底的培养皿中，使拟胚体贴壁。将培养基更换为含有β-E2、TGF-α、EGF、PDGF-BB及10%血清的分化培养基。3组均于第2周，将分化培养基中的血清浓度降为5%，第3周，将培养基更换为不含血清的分化培养基。诱导分化过程总历时21 d。培养所得的终末细胞经流式细胞术检测，共培养组16.4%的细胞分化为子宫内膜上皮细胞，细胞因子组7.1%的细胞分化为子宫内膜上皮细胞，拟胚体悬浮组6.2%的细胞分化为子宫内膜上皮细胞[18]。分化细胞中，非经典Wnt信号通路配体Wnt5a基因表达量明显高于未分化细胞。后续实验在分化过程中加入Wnt5a可促进分化，使分化效率提高；Wnt通路抑制剂分泌性卷曲相关蛋白（sFRP2）则抑制分化，使分化效率降低[19]。

另有研究报道，使用共培养法及细胞因子法（β-E2，EGF，PDGF-BB）对自主建系的hESCs进行诱导分化，分为共培养加细胞因子组、共培养组和细胞因子组3组[11]。与前一报道[18]不同的是，此分化培养基为含有β-E2、EGF和PDGF-BB的DMEM/F12培养液。诱导分化12 d后，对各组细胞进行传代，分化35 d后，对各组分化细胞进行免疫荧光检测，共培养加细胞因子组约有80%的细胞分化为子宫内膜上皮细胞，15%的细胞分化为子宫内膜间质细胞；共培养组约有70%的细胞分化为子宫内膜上皮细胞，部分细胞分化为子宫内膜间质细胞；细胞因子组35%的细胞分化为子宫内膜上皮细胞，部分细胞分化为子宫内膜间质细胞。以上结果表明，添加细胞因子的不同种类会影响hESCs向子宫内膜细胞分化的方向，添加TGF-α可能利于hESCs向子宫内膜上皮细胞方向分化。

1.2 UC-MSCs UC-MSCs来源于新生儿废弃脐带组织，易于体外培养，具有多向分化的能力，因其免疫原性低、增殖周期短和存活时间长被广泛应用于干细胞移植研究中[20-21]。有报道将人UC-MSCs向子宫内膜样细胞分化，采用共培养加细胞因子法、单纯共培养法，同时设置对照组。在共培养加细胞因子组中，将人UC-MSCs种于六孔板底，子宫内膜间质细胞种入transwell嵌套中，加入含有β-E2、TGF-α、EGF、PDGF-BB及2%胎牛血清的分化培养液；在单纯共培养组中，共培养体系加入含有2%胎牛血清的DMEM/F12培养液。整个分化过程持续21 d后，免疫荧光结果显示，共培养加细胞因子组的分化终末细胞大部分角蛋白表达阳性，波形蛋白表达阴性，向子宫内膜上皮样细胞分化；而单纯共培养组及对照组细胞角蛋白及波形蛋白双阳性，未见定向分化[22]。这表明在诱导人UC-MSCs向子宫内膜细胞分化的过程中，需要子宫内膜细胞与细胞因子的共同作用。进一步探究在分化过程中起重要作用的通路过程中发现，在加入蛋白激酶A（PKA）通路激活剂8-BrcAMP后，人UC-MSCs与子宫内膜间质细胞共培养21 d，并在其他细胞因子（β-E2，TGF-α，EGF，PDGFBB）的协同作用下，分化后的细胞波形蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性，提示人UC-MSCs向子宫内膜间质细胞方向分化。这表明在诱导分化过程中，不同分子化合物的添加及不同通路的激活或抑制，会影响人UC-MSCs向不同种类子宫内膜细胞的分化方向。

2 动物实验

2.1 干细胞异种移植 在动物实验中，不同种类、不同来源的干细胞移植治疗子宫内膜损伤的效果显著。来源于脂肪组织的脂肪干细胞具有多系分化的能力，具有临床应用价值。有报道将绿色荧光蛋白（GFP）标记的脂肪干细胞注入子宫内膜损伤的模型大鼠中。30 d后，大鼠损伤的子宫内膜微血管密度增高，子宫内膜厚度及腺体数量增加，并且在后续的妊娠实验中，60%的大鼠成功受孕，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）[10]。在另一项研究中，UCMSCs经尾静脉注射入子宫内膜损伤的模型大鼠体内，SD大鼠内膜损伤部位的纤维化及炎症状态显著缓解，子宫内膜细胞及新生血管显著增多[23]。但单纯使用干细胞移植，移植后细胞种植率较低，促进子宫内膜修复再生的效率较低。

2.2 组织工程研究 随着人们对不同种类干细胞的深入研究，组织工程学得到了长足的发展。组织工程学是一门交叉学科，旨在制造新的组织，替代因疾病或创伤受损的人体器官[24]。在组织工程学中，组织由三个重要部分构建而成：支架、细胞因子及细胞。支架可以通过分泌可溶性因子，为细胞提供生存微环境；也可通过固相支持，使细胞黏附、迁徙，进一步形成组织。目前，研究报道的支架种类有胶原蛋白支架、透明质酸支架等。种植于胶原支架上的UC-MSCs，可以通过旁分泌的方式促进子宫内膜细胞增殖，减轻子宫内膜细胞凋亡[25]。细胞因子影响了细胞的表型、代谢、迁徙等过程，所添加的细胞因子种类的选择，可参照器官生理形成过程中起重要作用的细胞因子。而细胞则是最重要的组成部分，细胞具有很多功能，包括合成组织基质、维持组织稳态、与机体原有组织整合等作用。分化终末态细胞因其安全性高被广泛应用于组织工程学中[26]。

已有多个实验将干细胞治疗方案与组织工程学结合，应用于动物实验中。有学者采用MSCs分泌因子与透明质酸凝胶结合，在体外的划痕实验中，与对照组相比，24 h后，MSCs-透明质酸凝胶组划痕间距变小，差异有统计学意义（P＜0.05）。将含有MSCs分泌因子的透明质酸凝胶注射入子宫内膜损伤的SD大鼠子宫中后，子宫内膜损伤情况得到改善，子宫内膜厚度增加，腺体数量明显增多。并且在后续的妊娠实验中，接受MSCs-透明质酸凝胶治疗的SD大鼠子宫妊娠囊数量明显多于单用MSCs分泌因子组及单用透明质酸凝胶组[27]。另有研究将SD大鼠的骨髓MSCs 在体外培养扩增，与维生素C 及水凝胶（Pluronic F-127）混合后注射到子宫内膜机械损伤的SD大鼠模型中，移植8周后，维生素C增强了骨髓MSCs在水凝胶内的活性，SD大鼠子宫内膜增厚，腺体数量增多，纤维化区域明显减少，且细胞角蛋白表达量上升，炎性因子IL-1β表达量明显下降[28]。也有研究报道，将由hESCs诱导分化而成的子宫内膜样细胞种入胶原支架，注射入子宫角机械损伤的SD大鼠模型中，与对照组相比，子宫无明显水肿，并于后续的妊娠实验中，在子宫损伤区域出现妊娠囊[11]。这些实验虽然获得了较好的前期结果，但尚不能得到临床应用。

2.3 富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）联合干细胞治疗 PRP是包含高浓度血小板及自体血浆的血液衍生物，富含多种血浆蛋白、生长因子及细胞因子，具有抗菌杀菌、促进组织伤口愈合等作用[29]。已有研究表明，薄型子宫内膜患者宫腔灌注自体PRP后，子宫内膜显著增厚，后续胚胎移植临床妊娠率显著提升[30-32]。2018年“辅助生殖技术中异常子宫内膜诊治的中国专家共识”中，国内生殖医学领域专家建议对薄型子宫内膜患者选择药物、PRP灌注、干细胞移植等联合治疗方案[33]。有研究将PRP与经血干细胞注射到子宫内膜机械损伤的大鼠子宫内，18 d后大鼠子宫内膜增厚，新生血管增多，炎症及纤维化状态明显改善，PRP与经血干细胞联合治疗组效果优于单用经血干细胞或单用PRP治疗组[34]。也有研究表明，PRP可提高骨髓间充质干细胞修复IUA模型大鼠子宫角的效果，促进胰岛素样生长因子1（IGF-1）和白细胞介素10（IL-10）在再生的子宫内膜组织的表达，增强骨髓间充质干细胞的三系分化能力[35]。这些实验表明，PRP与干细胞疗法联用，对临床患者治疗效果更佳。

3 临床试验

3.1 骨髓源性干细胞 从骨髓中分离的干细胞具有多向分化能力，可在适宜条件下诱导分化为目的细胞。骨髓源性干细胞参与了人子宫内膜的修复再生过程[36]，在人体内可以分化为子宫内膜间质细胞及腺上皮细胞[37]。但目前尚未明确参与子宫内膜修复过程的骨髓源性干细胞的具体亚群。

有研究报道，抽取患者自身的骨髓组织进行体外流式分选后，将骨髓源性干细胞经宫颈注入患者子宫宫腔中，后续补充雌激素并服用阿司匹林，137 d后，患者子宫内膜厚度增至6.9 mm，胚胎移植后患者成功妊娠[38]。

另有研究分别获取16例30～45岁女性患者的骨髓源性干细胞，流式分选出CD133阳性细胞后，经动脉回输对患者进行治疗，2个月后患者子宫内膜厚度显著增加（4.3 mm vs.6.7 mm，P=0.004），宫腔粘连情况改善，16例患者中有3例在治疗后自然受孕，其中1例患者成功诞下婴儿。但抽血及回输操作会对患者造成一定的感染风险，并且不利于反复操作[39]。同时，骨髓间充质干细胞分化能力与患者年龄相关，在临床应用中仍需注意这一问题。

也有研究使用集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，G-CSF） 动员患者产生造血干细胞，抽血经流式分选后将获得单核细胞经阴道侧穹隆穿刺注射入子宫肌层与内膜交界处，后续使用口服雌激素治疗9个月后，患者的子宫内膜由（1.38±0.39）mm增至（5.48±1.14）mm，其中5例患者恢复月经。而这些患者此前均接受过2～3次宫腔镜治疗并规律服用雌激素，但并未起效。这一试验未报道经治疗后患者妊娠情况[40]。

3.2 经血干细胞 经血干细胞是从女性月经中分离出来的成体干细胞，表达干性标记物OCT-4[41]和阶段特异性表面抗原3/4（SSEA-3/4）[42]，具有多向分化能力，因获取过程无创，而被广泛应用于基础研究。有研究收集患者的月经，体外培养分离患者的经血干细胞，再回输入宫腔，对宫腔重度粘连（Ⅲ～Ⅳ级）的患者进行为期3年的治疗。7例患者的经血干细胞在体外条件下被成功分选培养，回输入患者宫腔内后，5例患者的子宫内膜增至7 mm，其中1例患者自然受孕，4例患者接受了后续的冻胚移植，2例患者成功受孕[9]。但对于月经稀发、闭经的患者，经血干细胞难以培养成功，这是在临床应用中需要考虑的问题。

3.3 UC-MSCs 具有低免疫原性的UC-MSCs，因其获取过程容易，体外培养技术成熟，被广泛应用于细胞实验及动物实验中。但由于其异体性来源，UCMSCs的临床应用存在争议。有研究将同种异体UCMSCs种植于胶原支架中，经导管注入26例宫腔粘连患者宫腔内，后续进行雌孕激素替代治疗；3个月后患者子宫内膜增厚，宫腔粘连状况改善；DNA短串联重复序列（short tandem repeat，STR）分析结果显示，患者再生的内膜组织未检测出异体性核酸；30个月随访过程中，10例患者成功受孕，8例患者诞下无出生缺陷的健康新生儿[43]。这为IUA的临床治疗提供了新的治疗思路。

3.4 ADSCs 人体中含有大量的脂肪组织，可从大腿、腹壁、手部等皮下脂肪组织中获取ADSCs。ADSCs具有多向分化能力，因其来源广泛、易于获取和体外培养增殖活性高，而被应用于伤口修复及皮肤组织再生。同时，ADSCs分泌的细胞因子，具有抗炎作用，已被应用于多发性硬化、克罗恩病等炎性及免疫疾病中[44]。

有研究通过抽脂获得患者的脂肪组织，将含有脂肪干细胞、脂肪基质血管成分的组织经宫颈注入患者子宫中，后续进行雌激素补充治疗；5例患者中有2例恢复月经，3例月经量增多，子宫内膜由（3.0±1.0）mm增至（6.9±2.9）mm（P=0.043）；接受胚胎移植后，其中1例患者怀孕，但在妊娠第9周自然流产。这表明脂肪组织治疗可使IUA患者月经恢复，但患者妊娠率并没有明显提升[45]。后续研究应关注ADSCs治疗是否能改善患者的妊娠率。

4 局限性及展望

干细胞疗法虽在动物实验及一些临床前驱性试验中获得了积极成果，但样本量均较小，且并未设置对照组。在大范围推广过程中仍有以下两个因素需要考虑：①干细胞培养及分化过程中不能有动物源性成分存在；②所使用干细胞的来源上，自体来源为最佳选择，异体来源需考虑临床应用安全性及伦理学问题。基于其强大的再生、分化及修复能力，干细胞疗法为临床上宫腔粘连及薄型子宫内膜患者提供了除药物治疗、手术治疗外新的可能，期待未来干细胞疗法能够尽快完成从基础实验到临床应用的转化，造福广大患者。