颗粒细胞和卵母细胞的自噬及其研究进展

施陈楠，崔毓桂

婴儿出生时，卵巢内约有70万～200万初级卵母细胞。出生后，卵母细胞不断闭锁，至青春期，只有40万个左右。前期卵母细胞闭锁速率是相对恒定的，一直到37.5岁闭锁速度加快。卵泡发育各阶段发生异常均可导致疾病发生，如卵巢早衰（POF）、原发性卵巢功能不全（POI）等疾病与始基卵泡池过小、卵泡闭锁加速和卵泡募集或功能异常有关，导致卵子数量和质量下降，女性生育力减低。近年研究指出，自噬（autophagy）参与了卵泡储备建立与维持、卵巢卵母细胞老化的生理过程，以及POF、POI及多囊卵巢综合征（PCOS）的病理过程。因此，自噬可能是排卵异常性疾病潜在的治疗靶点[1-4]。本文综述颗粒细胞和卵母细胞的自噬及其机制，以及自噬与卵泡异常性疾病的相关关系。

1 自噬及其调节

自噬是一种保守的降解途径，通过双层膜结构的囊泡包裹吞噬自身细胞质蛋白或细胞器，然后与溶酶体融合使得降解酶降解囊泡内物质[5]。自噬是适应性的过程，在不同形式的应激情况下发生，包括营养缺乏、生长因子缺失、氧化应激和缺氧等；自噬还参与很多病理过程，如神经退行性病变、肿瘤发生、感染性疾病等[6]。自噬可分为微自噬（mA）、伴侣介导自噬（CMA）和巨自噬（MA）。其中，巨自噬是最常见的自噬形式，如“线粒体自噬”是选择性降解功能障碍的线粒体，因此，通常将巨自噬简称为自噬。

近年研究表明，自噬与细胞的氧化应激损伤相关。在氧化应激条件下，通过沉默信息调节因子1（SIRT1）/过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α（PGC-1α）/腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）和蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素复合物1靶点（mTORC1）信号通路自噬可以清除功能紊乱的细胞器和错误折叠的蛋白质，如受损的线粒体和过氧化物酶体，减轻细胞的氧化应激，阻止心肌细胞老化，改善心肌病的发展进程[7]。有研究表明，敲低磷酸酶和紧张素同源物诱导激酶1（PINK1）可诱导线粒体伸长，引起线粒体功能异常，进而引起氧化应激、ATP生成异常，以及显著增加的自噬和凋亡[8]。

在肥胖、2型糖尿病和慢性肾脏疾病中，自噬被激活，从而减轻葡萄糖和脂质中间体对细胞的损伤，清除功能障碍的细胞器或减少其积聚，因此有效减轻细胞内的氧化应激[9]。在卵巢中，自噬参与调节卵泡发育和颗粒细胞、卵母细胞死亡导致的卵泡闭锁。卵泡闭锁是通过细胞凋亡的途径和程序性细胞死亡的非凋亡途径从卵巢清除生殖细胞。其中，自噬在决定卵泡发育成熟或闭锁消失中发挥关键性作用[3]。在真核生物中，虽然父本线粒体会少量地进入卵胞浆，但线粒体DNA（mtDNA）为母系遗传，其机制可能是父本线粒体的自噬性退化[10]。Rojansky等[11]发现，具有E3泛素蛋白连接酶活性的蛋白（PARKIN）和线粒体E3泛素蛋白连接酶1（MUL1）在清除父本线粒体过程中发挥重要作用。

2 影响颗粒细胞和卵母细胞自噬的因素

影响卵巢中细胞自噬的因素较多，如出生时营养缺乏可在卵巢中出现代谢适应性反应和氧化反应，引起颗粒细胞和卵母细胞自噬增加及细胞凋亡，影响生发泡破裂和卵泡募集[12]。卵巢内的活性氧簇（ROS）积聚导致氧化应激，引发颗粒细胞和卵母细胞自噬超激活，影响卵巢细胞特别是卵母细胞的生理活动，进而影响激素合成与分泌以及卵母细胞发育成熟。研究发现，缺氧和ROS诱导的自噬是通过AMPK-哺乳运动雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、内质网应激/非折叠蛋白反应（UPR）以及蛋白激酶Cδ（PKCδ）-c-Jun氨基末端激酶1（JNK-1）等信号通路来调控的[1]。

原始卵泡或正在生长的卵母细胞中的mTOR依赖性通路不同程度地影响卵泡发育、卵母细胞基因组完整性的维护、卵母细胞的基因表达、减数分裂和着床前发育能力。mTOR的条件敲除（cKO）导致原始或生长卵泡闭锁，以及不同程度地影响卵泡发育、颗粒细胞存活、卵母细胞质量，直至不孕[13]。ROS还通过抑制SIRT1表达，进而下调细胞内SIRT1-叉头盒蛋白O3a（FOXO3a）-超氧化物歧化酶2（SOD2）轴，增加氧化应激；ROS-氧化应激-ROS回路，导致线粒体功能持续降低和自噬水平降低，因而卵母细胞发育和成熟受损[14]。

氧化应激介导的颗粒细胞凋亡，影响颗粒细胞和卵母细胞之间的沟通，包括营养物质供应和卵母细胞成熟促进因子，因而影响排卵前卵母细胞的质量[15]。此外，环境物质和药物毒物可能影响颗粒细胞和卵母细胞的自噬。T-2毒素代谢物HT-2是最毒的三聚氰胺真菌毒素之一，可诱导小鼠卵母细胞的自噬，影响卵母细胞成熟[16]。将雌性小鼠暴露于香烟烟雾的实验表明，吸烟会抑制卵巢细胞的自噬，受损细胞和蛋白质不能被清除，因而造成卵巢卵泡发育的损伤，导致女性生育力下降[17]。

3 颗粒细胞自噬及其对卵母细胞的影响

颗粒细胞的自噬调节颗粒细胞自身的活性，并通过颗粒细胞与卵母细胞的相互作用参与调节卵母细胞的发育和成熟。卵泡刺激素（FSH）通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT-mTOR信号通路和下调FOXO1信号通路，抑制氧化应激诱导的颗粒细胞自噬[4]。也有研究发现，褪黑素通过PI3K-AKTFOXO1轴和SIRT1-FOXO1-自噬相关基因7（ATG7）通路抑制自噬，减少颗粒细胞的氧化性损伤[2]。然而，FSH也通过上调小鼠颗粒细胞中的缺氧诱导因子1α（HIF-1α）促进自噬的激活，选择性地清除受损、退化的线粒体，对颗粒细胞增殖和细胞活性起保护作用[18]。

Beclin1（BECN1）是肿瘤抑制基因，其缺失会影响细胞的脂质代谢和类固醇产生[19]；Beclin1也是HIF-1α的下游因子，因此也是一种重要的自噬蛋白，参与缺氧诱导的自噬[18]。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的自噬和颗粒细胞死亡之间有着紧密的联系[4]。脂质过氧化和ox-LDL水平升高会导致细胞的氧化应激，从而引起肥胖女性或PCOS患者的不排卵和不孕；抗氧化剂白藜芦醇（RES）和铁剂（DFO）减轻颗粒细胞ox-LDL诱导的损伤和自噬，对颗粒细胞起保护作用[20]。

除胞质自噬外，卵巢颗粒细胞和卵丘细胞的细胞核中存在“核自噬”。研究发现，翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）通过颗粒细胞核自噬，参与调节卵泡发育。一方面，TCTP通过HIF-1α介导的磷酸甘油酸激酶1（PGK1）表达上调促进能量合成，另一方面，TCTP通过AMPK途径促进核自噬[21]。

颗粒细胞和卵丘细胞向卵母细胞传递营养物质、生长因子和存活因子，因此颗粒细胞自噬水平会影响卵母细胞的发育。抑制卵丘细胞的双特异性磷酸酶1（DUSP1）会减少ROS累积、提高谷胱甘肽（GSH）水平和线粒体膜电位，降低细胞自噬水平，从而导致细胞周期进程异常，促进细胞增殖、降低凋亡率，引起胆固醇合成增多和乳酸含量增加，促进卵丘细胞扩展，进而影响卵丘-卵母细胞复合体的细胞间相互作用[22]。体外培养人卵丘细胞，发现线粒体解偶联蛋白2（UCP2）介导ROS产生、调节细胞凋亡和自噬、促进孕酮合成，以及维持卵丘-卵母细胞的间隙连接完整性，表明UCP2参与调节卵泡发育，影响卵母细胞质量[23]。因此，颗粒细胞和卵丘细胞的ROS水平升高，介导细胞自噬，进而影响卵泡发育和卵母细胞质量。

4 卵母细胞自噬与卵巢储备和卵母细胞排卵后老化

雌性哺乳动物的卵巢原始卵泡池决定其生殖寿命。自原始卵泡池建立，持续存在的卵母细胞程序性丢失，致卵泡池慢慢耗竭；细胞凋亡和自噬参与上述过程。赖氨酸特异性脱甲基酶1（LSD1）通过自噬底物p62途径和去甲基化酶作用下调自噬水平，从而减少卵母细胞程序性死亡[24]。禽成纤维细胞病病毒致癌基因类似物2（MYBL2）-电压依赖性阴离子通道（VDAC2）-自噬相关因子BECN1-Bcl-2样蛋白1（BCL2L1）通路与自噬抑制相关。也就是，珠蛋白转录因子1（GATA1）和MYBL2结合并激活VDAC2启动子，MYBL2调节线粒体VDAC2的表达，而VDAC2通过BECN1-BCL2L1复合体发挥抑制自噬的作用[25]。过多的自噬，促进原始卵泡池的生殖细胞丧失；这个过程也受表观遗传调节因子SIRT1的调控[26]。研究显示，褪黑素可以通过抗氧化、维持端粒、促进SIRT1表达和核糖体功能以及减少卵母细胞的自噬，延缓卵巢衰老[27]。尼古丁会通过诱导卵母细胞和颗粒细胞自噬，损伤卵母细胞质量和颗粒细胞增殖，加速原始卵泡池的耗竭；褪黑素可以减少ROS生成、降低尼古丁诱导的卵母细胞自噬[28]。因此，卵母细胞自噬参与卵巢中原始卵泡池的建立和成年后卵泡储备的维持。

卵母细胞成熟后若不能在最佳时间受精，则会发生“排卵后老化”。在辅助生殖技术，卵母细胞体外培养是不可避免的，体外培养时间的延长则可能导致卵母细胞的体外老化。氧化应激是排卵后卵母细胞老化的关键机制，参与诱导卵母细胞凋亡和自噬。研究发现，泛醌-10通过加快线粒体更新，延缓卵母细胞的排卵后老化。老化卵母细胞发生氧化应激，ROS积累，细胞成分受损，增加的自噬以消除受损的细胞成分；当受损的细胞成分被清除，自噬作为一种适应性反应而随之减少[29]。在卵母细胞成熟后老化（PMOA）的早期阶段，增加自噬是一种适应性的反应，阻止细胞凋亡；但是，在PMOA晚期，更多细胞凋亡蛋白酶（caspase）的激活，触发卵母细胞老化的级联反应，包括卵母细胞形态学异常、线粒体功能障碍、凋亡严重，阻碍了自噬过程[30]。小分子抗氧化物——腐胺可以通过上调线粒体丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）表达和改善线粒体活性延迟排卵后卵母细胞的衰老过程[14]。所以，卵母细胞自噬调节线粒体功能，是调节卵母细胞成熟和PMOA的重要环节。

5 卵巢的细胞自噬与女性生殖疾病

卵巢的细胞自噬，作用广泛，包括参与原始卵泡池的建立与维持、参与卵泡发育和卵母细胞质量、保护胚胎mtDNA母系遗传和维持妊娠等。研究表明，卵巢中合适的细胞自噬水平维持正常的卵泡发育、闭锁过程，自噬异常与PCOS、POI等卵泡发育障碍疾病的发病机制相关；褪黑素等通过PI3K-AKT-mTOR和AMPK等经典通路调节自噬水平，影响颗粒细胞活性和卵母细胞发育。因此，自噬成为PCOS、POI等疾病治疗的潜在靶点。

5.1 卵巢衰老 卵巢衰老的特征是卵母细胞数量和质量的逐渐下降。在细胞衰老过程中，细胞内ROS升高，诱导自噬水平增加。微管相关蛋白1轻链3a（LC3a）和LC3b是自噬体膜的结构蛋白，是细胞自噬水平的生物标记物，在褪黑素处理后LC3a和LC3b表达下调。褪黑素通过抑制氧自由基或通过真核起始因子2 （eIF2）、生长阻滞和DNA 损伤诱导45（GADD45）和选择阅读框（ARF）等通路，减少氧化应激，并因此抑制自噬、促进细胞生存[27]。卵母细胞老化进程中，脂褐素累积。脂褐素是一种ROS诱导产生的废物色素，是衰老细胞溶酶体的标志。脂褐素使细胞对氧化应激的敏感性增强，溶酶体与自噬体融合的能力减弱，降低受损蛋白的清除效率，导致ROS和氧化受损蛋白的积累[31]。

5.2 POI POI也称卵巢早老化（POA），是指由于卵泡过度损耗或功能异常引起女性在40岁以前出现的高促性腺激素性腺功能减退，是女性不孕的主要原因之一。在POI女性，自噬相关基因ATG7和ATG9A导致自噬体生物合成减少，从而导致自噬功能受损，影响原始卵泡保存和卵巢储备[32]。特异性敲除生殖细胞的自噬诱导基因ATG7，导致卵巢卵泡严重丢失，雌鼠生育能力低下，这与人类POI十分相似，提示自噬相关基因ATG7可能是女性POI的潜在致病基因[33]。

5.3 PCOS PCOS是以高雄激素血症、少/无排卵、多囊样卵巢为特征的临床综合征。近年发现PCOS卵巢中，细胞自噬水平升高。在PCOS患者中，自噬体数量增加，自噬底物P62的蛋白质水平降低，细胞自噬标记物Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3b-Ⅱ（LC3b-Ⅱ）的水平升高，PINK1和PARKIN的蛋白质水平升高，而SIRT1的水平降低。褪黑素治疗可显著增加SIRT1的蛋白质水平、降低PINK1/PARKIN的水平，同时改善了线粒体功能障碍，因此改善PCOS表型[34]。在PCOS合并胰岛素抵抗（IR）患者的颗粒细胞中，细胞损伤相关的分子——高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的丰度显著增加，颗粒细胞自噬增强[35]。在用DHEA造模的小鼠PCOS卵巢中，SIRT1上调，AMPK激活增加，表明SIRT1/AMPK轴参与调节PCOS卵巢中的自噬[36]。PCOS大鼠的卵巢颗粒细胞，自噬标记蛋白LC3b增加，而自噬底物SQSTM1（sequestosome 1）/p62的水平降低[37]。在另一项研究中，PCOS患者卵泡膜细胞中p62和泛素水平升高，诱导细胞色素P450 17A1（CYP17A1）和纤溶酶原激活物1（PAI-1）表达。基于CYP17A1和PAI-1 mRNA通过ROS/p38和JNK信号通路，抑制膜细胞的自噬，因此p62可能参与PCOS的病理过程[38]。因此，PCOS发病与卵巢中细胞自噬的确切关系仍需进一步研究。

6 结语与展望

卵巢的细胞自噬参与原始卵泡池建立和卵母细胞程序性丢失，参与调节卵巢储备。当细胞出现氧化应激时，ROS通过PI3K/AKT、AMPK-mTOR等通路引起自噬水平异常升高，颗粒细胞凋亡增加、活性受损，影响卵丘-卵母细胞复合体的细胞间相互作用，致卵母细胞质量受损。在老化的卵母细胞或POI、PCOS等生殖相关疾病，ROS诱导的卵母细胞自噬水平升高，导致卵母细胞线粒体功能受损、卵泡过度损耗。但是，卵巢内不同细胞的自噬以及与女性生殖疾病发生发展的关系，仍需进一步研究。深入研究卵巢中颗粒细胞与卵母细胞自噬发生和调节的相关机制，为卵泡发育障碍相关疾病的临床治疗提供新思路。