DNA条形码技术在动物类中药鉴定中的应用研究进展

冯红英

动物类中药材具有疗效突出、不良反应发生率低等特点，在我国中医药行业中占据重要地位。动物类中药材大多来源于动物的不同组织或者器官，如：干燥全体、角、甲、壳、骨等，传统性状鉴定应用具有局限性。分子鉴定技术为动物类中药材的鉴定提供了新的技术手段。DNA条形码鉴定技术可以实现对物种进行快速鉴定，成功突破了传统中药鉴定技术对专业知识的要求。笔者对DNA条形码技术在动物类中药鉴定中的应用研究进展展开综述，为保护珍稀药用动物中药资源提供理论依据。

1 DNA条形码技术

DNA 条形码的概念由加拿大动物学家Paul Hebert首次提出，是指使用一段较短的、标准的、易扩增的DNA片段对物种进行快速、准确、标准化的鉴定。DNA条形码是以DNA序列为检测对象，在物种个体发育过程中DNA序列不会改变，样本受损也不会影响DNA识别结果；DNA条形码技术是可以机械重复；DNA条形码技术用于物种鉴别具有较高的准确性；还可以建立DNA条形码数据库，可以实现一次性快速鉴别物种样本。DNA条形码技术用于动物类中药鉴定的主要技术流程为：采集样品→处理样品→提取DNA→设计、合成引物→提交结果至数据库进行分析。主要分析方法有序列比对、系统树构建、条形码间距检验等。

2 DNA条形码在动物类中药鉴定的应用现状

在动物类中药材中，COI序列是公认的DNA条形码标准序列，有研究者提出将ITS2序列作为动物类中药材鉴定中的辅助序列。本文根据动物类中药的药用部位分类，总结与阐述DNA条形码在动物类中药鉴定的应用现状。

2.1 肌肉类中药材肌肉类中药材指的是入药部位为动物干燥全体、器官、肌肉纤维类中药，此类中药的DNA条形码鉴定应用比较广泛，如蜈蚣、全蝎、蛤蚧、水蛭等中药材。蜈蚣具有息风止痉、攻毒散结、通络止痛的功效，常与全蝎相须为用，蜈蚣、全蝎功效显著，在药材市场上掺伪品较多，在蜈蚣的传统鉴别上，主要是根据蜈蚣的体型大小、背板颜色、步足等性状特征[1]，鉴别准确度较低，DNA分子鉴定已经广泛应用于蜈蚣的基原鉴定。张红印等[2]采用DNA条形码技术鉴定蜈蚣药材，基于COI条形码技术对蜈蚣药材进行DNA提取，进行PCR扩增，双向测序，使用MEGA6.0软件进行序列比对、遗传距离分析以及构建系统聚类数，结果发现使用COI序列条形码可以准确鉴别蜈蚣药材正品以及掺伪品，可以有效用于蜈蚣药材的质量控制与监控。蛇类中药材是中医药资源的宝库，来源复杂,金钱白花蛇没有毒性，在临床上具有广泛的应用[3]。廖婧等[4]通过分子鉴定技术构建华南地区20余种常用蛇类中药材的DNA条形码数据库，主要用于蛇类中药材的分子鉴定；该研究者还应用DNA条形码技术快速鉴别金钱白花蛇及其伪品。张红印等[5]利用COI序列作为条形码序列，对蛤蚧中药材以及掺伪品进行DNA提取，进行PCR扩增以及双向测序，采用MEGA6.0对蛤蚧药材所有11个物种的103份样品进行序列比对，构建邻接树，基于COI序列构建的邻接树中蛤蚧正品单独聚在一起，可与蛤蚧伪品进行准确区分，为保障蛤蚧中药材的临床用药安全以及药材市场监控提供有效方法。吕盼等[6]采用PCR技术，基于COI序列对水蛭科动物药材水蛭、蚂蟥、柳叶蚂蟥以及各地方常用品种进行分子鉴定，构建水蛭的DNA条形码分子鉴定方法。地龙具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效，马梅等[7]收集地龙药材及其易混品种，提取DNA，得到COI和16SrRNA序列，经MEGA6.0软件分析，构建地龙中药材及其掺伪品的邻接树，结果发现地龙正品药材以及混淆品种间COI和16SrRNA序列存在较多的变异位点，16SrRNA、COI序列可以准确区分地龙药材及其掺伪品。

2.2 角骨类中药材角骨类中药材是指药用部位为动物的角、骨、刺、甲等药材的总称，这类药材的DNA含量较小，提取难度较大。鹿茸具有益气强志、补血的功效，价格比较昂贵，在中药材市场上掺伪品较多，目前DNA分子鉴定技术已经广泛应用到鹿茸、鹿角类中药材的鉴定[8]。刘冬等[9]对鹿茸、鹿角、鹿鞭、鹿筋、鹿尾、鹿胎分别进行DNA提取、COI序列扩增和序列测定，构建鹿类药材COI序列数据库，并对市售鹿类中药材进行调查分析。DNA 条形码技术可以作为鹿类中药材的有效鉴定技术，并为市售鹿类中药材的鉴定提供科学依据。王淼等[10]采用改良盐析法从龟甲样品中提取DNA，采用PCR技术鉴别中药材龟甲真伪品，改法具有特异性高、鉴别简单快捷、具有较强实用性的优点,在中药材龟甲的真伪鉴别上具有较高的应用价值。崔丽娜等[11]研究龟甲及其掺伪品的原动物COI序列,采用MEGA 4.0软件进行遗传距离分析，并构建龟甲及其混淆品种的NJ树，为龟甲中药材的准确鉴定提供了有效的分子遗传标记方法。穿山甲是我国的一种名贵中药材，市场需求量较大，贾静等[12]验采用试剂盒法提取穿山甲及其混伪品的DNA，采用COI序列作为DNA条形码对穿山甲及其掺伪品进行准确鉴定，为穿山甲的分子鉴定提供了科学依据。

2.3 其他类中药材在贝壳类中药材的鉴定上，使用DNA条形码鉴定此类中药材，多选取新鲜活体作为研究对象，进行DNA条形码分类分析[13]。胶类中药材多属于贵重类中药，由于炮制加工方法特殊，掺伪现象普遍存在，鉴别难度较大，DNA分子鉴定可以实现快速、准确鉴别胶类中药材。阿胶是我国传统的名贵中药，被列为“补血圣药”，阿胶是驴皮熬制的固体胶，价格昂贵，在中药材市场上掺伪品较多，罗晖明等[14]采用PCR-RFLP法，以Cytb基因为目标基因，驴源性成分Cytb的PCR产物能够被限制性内切Ⅰ酶切成76 bp和314bp 2个片段，而掺伪品的源性成分均不能够被酶切，DNA条形码技术可以准确鉴别阿胶原料驴源性成分。

3 小结

一些动物药材，如骨骼类中药材、分泌物等DNA含量较低，在应用DNA分子鉴定时，需要采取改良的DNA提取方法[15]。还有一些动物类中药材，经过蒸煮、干燥等处理后，DNA降解比较严重，研究者开发出多种DNA条形码序列[16]，可用于辅助区分COI序列无法准确鉴别的动物类中药材。DNA条形码数据库是动物类中药材分子鉴定的重要参考依据，但许多中药材基源动物的DNA条形码序列尚未被 Gen-Bank数据库收录[17]。今后应进一步拓展DNA条形码技术在动物类中药材中的研究范围，针对特殊中药材应开发出更加有效的检测方法，完善基础数据库建设以及相关标准的制定，推动动物类中药材分子鉴定和产业化的深入发展。