早发性卵巢功能不全基因检测的研究进展

卢秋敏，姚吉龙

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI） 曾被称为卵巢早衰（premature ovarian failure，POF），是指在预期的绝经年龄（传统上为51岁）之前停止月经，为40岁以下女性的原发性性腺功能减退，主要表现为闭经、雌激素水平降低和促性腺激素水平升高。因既往POF无法反应卵巢功能衰退的变化过程，并且给患者增加心理负担，现已被替换为POI。POI是一种异质性、病因复杂的疾病，发生率约占40岁以下女性的1%[1]，30岁以下女性约为0.1%，20岁以下女性约为1/10 000[2]；在原发性闭经患者中占10%～28%，继发性闭经患者中占4%～18%[3]。

基因多态性及变异可能是POI的重要病因，主要涉及X染色体异常、基因突变、线粒体功能障碍等方面，POI相关致病候选基因主要集中在DNA损伤修复、同源重组和减数分裂等方面，新一代基因测序技术加强了对POI遗传因素的了解。现综合国内外POI基因检测进展，对POI发病的遗传学病因研究进展进行综述。

1 POI的家族聚集性

目前多种因素可以导致POI，如遗传因素、自身免疫性疾病、感染、环境因素及医源性因素，还有50%～90%的POF患者因病因不明被称为特发性POI。其中约10%～13%的POI患者存在染色体异常[4]，通过细胞遗传学、细胞基因组学和外显子测序等方法，可揭示20%～25%POI患者的遗传学病因主要为X染色体异常。约有12.7%～28.5%的POI患者有家族史，约5%的POI患者有明显的家族早绝经史，提示其存在家族聚集性。

2 染色体异常与POI

染色体异常是POI的主要致病原因，其中以X染色体异常较为常见。虽在POI患者中常染色异常报告相对罕见，但也不容忽视。

2.1 X染色体 X染色体在维持卵巢发育和功能方面起着至关重要的作用，X染色体异常发生率约占POF病例总数的13%[2]，占染色体异常的88%[5]，这突出了X染色体在卵巢功能中的重要性，最常见的异常如单体、三体、易位、缺失和拷贝数变异。X染色体异常对卵巢功能的影响机制可能是通过逃避X染色体失活的基因单倍剂量不足、重排对邻近基因“位置效应”的影响、非特异性扰乱减速分裂同源染色体配对或是表观修饰效应改变等机制，加速卵泡闭锁，进而引起卵巢功能衰竭。POI多伴有X染色体数目异常，因此建议对非医源性POI患者常规进行染色体核型筛查[6]。

2.1.1 X染色体数目异常 X染色体数目异常包括45,X及47,XXX。45,X是Turner综合征的典型核型，常表现为卵巢发育不良和原发性或继发性闭经，其卵巢特征性地由少量结缔组织和没有卵泡或仅少数闭锁性卵泡组成，即条纹性腺。Turner综合征的发病机制可能与卵泡加速闭锁有关，其在自发性流产中约占10%，约2 500例活产中有1例，这使得Turner综合征成为导致POI最常见的X染色体异常[7]。生殖细胞闭锁和卵巢衰竭程度因嵌合程度而异，即卵巢功能表型的相关机制与其基因剂量相关，因此在原发性闭经的患者中以无嵌合体的X单体更加常见。2014年Castronovo等[8]提出当整倍体细胞嵌合率为10%时可以作为青春期自然发育的预测指标。47,XXX较为少见，发生率约为1.5%～3.8%[9]，其确诊率低，约10%，临床表现多为月经过少、继发性闭经和围绝经期提前，或合并泌尿系统畸形，且常伴发自身免疫性疾病，如甲状腺或肾上腺疾病。推测X三体可能引起减数分裂障碍和（或）逃避X染色体失活的基因过度表达，从而导致卵巢功能衰竭。

2.1.2 X染色体结构异常 X染色体缺失、倒置、重复及X染色体与常染色体的平衡易位是导致POI发生的原因。X染色体上的 Xq13.3～Xq27和Xp11.1～p21片段与众多POI病例报道相关，是影响卵巢功能的关键区域。X染色体短臂的缺失通常导致原发性闭经，而X染色体长臂的缺失可导致原发性或继发性闭经。许多细胞遗传学研究表明，X染色体长臂在排卵缺陷中的作用大于X染色体短臂。

2.1.2.1 X染色体长臂结构异常 既往对Xq缺失和X-常染色体易位的研究发现，Xq存在卵巢功能和生殖寿命所必需的关键区域Xq13.3～Xq26/Xq27，此区域又分别被命名为POF1（Xq26～Xq28）和POF2（Xq13～Xq21），且多数平衡易位断裂点位于POF2区域。报道称，无论X染色体长臂缺失的大小如何，大部分患者都有月经稀发，其次是继发性闭经或卵巢功能衰竭。有研究表明若出现X染色体长臂末端区域缺失，可导致单倍剂量不足，X染色体失活逃逸基因可能影响卵巢功能，更容易出现POI，提示X染色体长臂的缺失可能通过改变染色体失活导致POF。目前已知的X染色体长臂上与POI相关的候选基因包括孕激素受体膜组分1（PGRMC1）、BCL6共抑制因子样蛋白 1（BCORL1）、氨基肽酶 P2（XPNPEP2）、AT2、脆性 X 智力低下 1（FMR1）、XIST、DIAPH2、DACH2、卵巢早衰蛋白 1B（POF1B）等，亦或可通过表观修饰效应导致基因功能的异常。

2.1.2.2 X染色体短臂结构异常 X染色体短臂上与POI相关的一个重要区域为Xp11.1～Xp21，其中与POI发病有关的基因包括泛素特异性蛋白酶9X（USP9X）、X染色体耦联锌指蛋白（ZFX）、骨形态发生蛋白15（BMP15）等。另外X染色体短臂Xp22.2重复区域包括矮小同源盒基因（SHOX）和卡尔曼综合征基因（KAL），可能与POI发生机制有关。推测SHOX基因的重复可能在染色体减数分裂中改变X染色体的配对，进而耗竭卵母细胞。

2.2 常染色体 目前常染色体异常与POI的相关性尚无定论。常染色体上存在激素相关基因，如雌激素受体 α（ESRα）、黄体生成激素受体（LHR）、卵泡刺激素受体（FSHR）、抑制素α亚基基因（INHA）等与POI的发生、发展有密切联系。常染色体上还有许多其他基因控制卵泡的凋亡和功能，如BAX、B细胞淋巴瘤因子2（BCL2）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（CDKN1B）、细胞色素P450芳香化酶（CYP19A1）、ESR1、叉头转录因子2（FOXL2）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶2（CASP2）和CASP3。目前报道的POI患者相关常染色体异常核型有 46，XX，t（2；15）（q32．3；q13．3）、46，XX，t（2；11）、45，XX，t（13；14）、46，XX，t（1；4）和46，XX，t（5；13）（q13；q14）等[10-11]。

3 基因突变与POI

目前研究发现，许多基因在卵巢发育过程及POI进展中发挥重要作用，但是在不同的研究中结论不一。

3.1 卵泡形成过程中调控的信号通路 雌性哺乳动物的生殖寿命主要取决于原始卵泡池的大小。在卵母细胞形成过程中，可通过卵泡激活将休眠中的卵泡招募进入生长中的卵泡池发育，随后进一步发育成为成熟卵泡，这一过程依赖许多信号通路[12]，如细胞增殖、存活、迁移、代谢的基础信号通路同源性磷酸酶张力蛋白-磷酯酰肌醇3激酶（PTEN-PI3K）通路，决定了始基卵泡生长的最终命运；动物模型还发现阻断Rictor/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2（mTORC2）通路会导致卵泡闭锁加速、功能性卵泡大量流失、性激素分泌异常等[13]；结节性硬化复合物1（Tsc）/mTORC1通路与PTEN-PI3K通路可以对始基卵泡发挥协同作用[14]；Hippo通路在始基卵泡激活前后的组分表达有明显差异[15]，这些信号通路相互协同、制约，维持女性正常的生殖寿命。

3.2 POI相关候选基因 目前发现与POI相关的候选基因多达百个，但已经证实与POI相关的基因仅有2个——FMR1和BMP15。这些候选基因多是在散发单个患者或家庭、散发人群或动物模型中确定的，存在样本量偏小、研究对象分类不明确等问题，导致无法在独立样本试验中进行验证。以下将从传统的遗传学分析技术和全新的基因测序技术两个方面对已发现的POI相关候选基因进行介绍。

3.2.1 传统基因检测发现POI相关候选基因 从原始卵泡到初级卵泡的转变包括卵母细胞的生长、颗粒细胞从扁平向立方状的分化以及卵泡膜细胞的再生。目前对动物模型的研究为POI提供了大量候选基因。

在原始生殖细胞迁移和增殖阶段，POU5F1是一种维持胚胎干细胞多潜能性的关键转录因子，其编码Octamer结合蛋白4（OCT4）参与干细胞的自我更新。2007年Choi等[16]发现POU5F1转录因子在NOBOX基因敲除的卵巢中的表达较未敲除的卵巢下调了30倍以上。2011年Wang等[17]首次对115例中国女性POI患者和149例健康对照者进行了POU5F1外显子区的扩增和测序，发现1例错义突变p.P13T。虽然POU5F1在卵泡发育中的作用尚不清楚，但其在新生卵巢中的重新表达可能是建立卵子重编程潜能的关键。

在始基卵泡形成和活化阶段，动物模型最早发现 FIGLA（factor in the germline α）是卵泡形成必不可少的转录因子之一，若将其敲除可观察到小鼠虽有原始生殖细胞迁移和增殖，但无法产生原始卵泡。人类胚胎早在14周时原始卵母细胞也表达同源性FIGLA，在POI患者中发现存在FIGLA杂合子突变[18]，提示FIGLA单倍剂量不足可导致POI。精卵发生特异碱性螺旋-环-螺旋蛋白1（SOHLH1）是目前所知的最早调控卵细胞发育成熟的转录因子[19-20]，能诱导卵母细胞特异性基因的表达，并与SOHLH2共同抑制原始卵泡的激活，基因缺失可导致快速的原始卵泡激活和卵泡死亡并导致POI。LIM同源盒基因8（Lhx8）编辑产物是转录调节因子，促进卵母细胞成熟所必需的多个基因的转录激活。Lhx8和NOBOX基因的表达受SOHLH1与SOHLH2调控。NOBOX是一种保守的同源结构域转录调节因子，在原始卵泡到第二次减数分裂中期（MⅡ）卵母细胞中均有表达，通过调节BMP15、生长分化因子9（GDF9）、叉头转录因子O3（FOXO3）等蛋白表达维持始基卵泡池的稳定[21]，敲除NOBOX基因的动物模型表现为卵母细胞加速丢失。已证实NOBOX基因缺失与高加索妇女发生POI相关[22]。PTEN基因通过PTEN-PI3K信号通路控制卵母细胞生长，主要抑制原始卵泡过早激活。研究发现，使用PTEN抑制剂可激活原始卵泡，若在此途径进行药物干预有望改善卵巢储备功能，激活因促性腺激素抵抗所致闭锁的卵泡，这种名为原始卵泡体外激活技术（in vitro activation of primordial follicles，IVA）的治疗方法在POI患者不孕症治疗的研究领域取得了重要进展[23]，其可抑制Hippo信号通路并已有成功妊娠的报道[24]。FOXO3为含有DNA结合域（FOX域）的转录因子，通过控制CDKN1B间接抑制原始卵泡的激活，维持卵巢中始基卵泡的静息状态，并参与蛋白激酶B（AKT）/FOXO3信号通路中的氧化应激机制[25]。CDKN1B基因又称为P27或KIP1基因，可抑制卵泡募集，促进卵泡闭锁，维持始基卵泡处于静息状态[26]，若突变会导致早期原始卵泡激活。另外Tsc1、Tsc2基因编码形成Tsc1/Tsc2复合物负向调节mTORC1的功能。

在卵泡发育阶段，GDF9和BMP15基因编码影响颗粒细胞分化功能生长因子的表达，进而影响卵母细胞的生长和功能。GDF9基因可促进颗粒细胞的增殖与卵泡膜细胞的分泌，从而影响卵母细胞的生长和功能。BMP15基因是卵巢内旁分泌调节机制相关调节分子，突变型BMP15的颗粒细胞生长减慢，可拮抗野生型BMP15对颗粒细胞增殖的刺激作用。

早期窦卵泡的形成需要依赖LH/绒毛膜促性腺激素受体（LHCGR）、FSH/FSHR、ESR1和 ESR2等激素调控，同时CYP19A1、GDF9和FMR1也起到重要作用。若FSHR基因突变可导致FSH信号传导能力显著降低，进而导致FSH分泌增加，影响卵巢储备功能。排卵时卵母细胞的释放需要BMP15、ESR1/2、CYP19A1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）和CYP11B1基因激活。而磷酸二酯酶3A（PDE3A）和cGAMP合成酶（MB21D1）基因可通过维持卵母细胞生长停滞来阻止排卵。

在综合征型POI相关的候选基因突变中，重点介绍FOXL2及FMR1基因。FOXL2基因是首个被认定可维持卵巢功能的常染色体基因，其突变可导致先天小睑裂综合征。现已发现100余种FOXL2基因突变，编码的转录调节因子可调节颗粒细胞增殖、分化和类固醇生成，突变的可能机制为颗粒细胞分化异常，导致始基卵泡储备缺乏，并通过上调抗苗勒管激素（AMH）来抑制原始卵泡的激活。位于Xq27.3的FMR1基因为脆性X综合征的致病基因，参与mRNA从细胞核到细胞质的转运，其致病机制可能与突变FMR1基因mRNA的积累加速卵泡闭锁有关。

3.2.2 新一代测序技术在POI遗传学病因的应用 对POI遗传因素的新一代研究技术包括拷贝数变异（CNVs）、全基因组关联分析（GWAS）和全外显子组测序研究（WES）等技术。大规模的GWAS可以用来预测绝经开始时的年龄，从而预测卵巢储备自然枯竭的位点。虽然发现的大多数基因的作用机制尚未明确，但新一代测序技术可用于发现基因组中某些含有候选基因的区域，与一代测序相比更具有高分辨率、高敏感度、高准确性等优点，在POI遗传病因学上的应用前景广泛，为探索卵巢功能不全和卵巢功能衰竭的候选基因提供更加深入的了解。新一代测序技术将有助于更好地发现参与复杂调控网络有关的候选基因[27]。

目前已经对候选基因进行许多关联研究，以确定各种候选基因是否可能参与POI的发展，候选基因主要涉及生殖功能，即编码各种性激素及其受体的基因，以及编辑参与内分泌通路的局部调节因子。2008年Kang等[28]首次对101例韩国POF患者和87例对照组女性进行GWAS，发现甲状旁腺素反应性B1基因（PTHB1）可能是POF的候选基因，并证实POF与2个PTHB1单核苷酸多态性（rs3884597和rs6944723）具有相关性。2009年Knauff等[29]对99例特发性白人POI患者及235例对照女性进行GWAS发现，血小板反应蛋白解整合素金属肽酶19（ADAMTS19）、脑源性神经营养因子（BDNF）、趋化因子配体 12（CXCL12）、LHR、USP9X、TATA 盒结合蛋白/TBP相关因子4B（TAF4B）基因可能与特发性POI存在关联。2012年Qin等[30]对我国391例POF与895例非亲缘关系对照女性进行GWAS发现，8q22.3位点区域明显的乙酰化修饰可能影响上下游基因的表达，导致POF易感。但是目前对POI进行GWAS的研究报道存在样本量受限、研究对象不明确的问题，因此给独立样本或其他种族的POI患者进行功能验证带来一定难度。

4 线粒体功能障碍与POI

卵泡发育对线粒体的显著依赖提示线粒体DNA（mtDNA）在POI的重要性，mtDNA数量和结构改变会导致氧化磷酸化水平降低，从而干扰线粒体自身的功能发挥，不能满足卵泡细胞在生长发育过程中对能量的需要，进而导致卵巢颗粒细胞及卵母细胞凋亡，即卵泡闭锁。据报道，卵巢功能不全的女性mtDNA拷贝数含量比卵巢功能正常的女性更低；另外与年龄匹配的健康女性进行线粒体基因组对比，发现POI患者线粒体细胞色素C氧化酶1基因突变率增加[31]。因此，对血液中mtDNA含量的测定可能成为预测POI风险的有效手段。

5 微小 RNAs（miRNAs）

基因组包括DNA序列遗传信息和表观遗传学信息，后者主要包括基因选择性表达的调控以及基因转录后的调控（小干扰 RNAs和 miRNAs）。MiRNAs是一类具有调节功能的小分子非编码RNA，长度约为20～24个核苷酸，通过mRNA降解和抑制翻译起始机制在转录后对基因表达进行微调，是基因表达的负调控因子，与卵泡闭锁关系紧密。2015年Dang等[32]对140例中国POF患者进行miRNAs检测发现，有22种miRNAs表达升高，29种miRNAs表达下降，并提出miR-22-3p表达异常可诱发POF。2018年Dang等[33]对月经表现尚正常但促性腺激素升高的30例POI患者检测发现，体内miR-379-5p过表达可抑制颗粒细胞增殖。目前已经认识到许多基因组的非编码部分可影响表观基因组，对miRNAs进行分析将是POI遗传病因学研究的一个全新领域，靶向特定的miRNAs或许是治疗卵巢相关疾病的潜在治疗方式[34]。

6 结语

目前很大一部分POI病例的发病原因并不能用现有已经发现的少数基因来解释，大多数诊断POI的女性往往会出现焦虑、疑惑、影响生育功能及绝经期的症状导致生活质量有所下降，因此，建议尽可能识别特定的基因缺陷，早发现、早干预。

在过去几十年中，虽然筛查出许多候选基因，但少有研究涉及对基因间因果关系与功能的验证，大多数暂未通过功能验证的研究存在明确的因果关系，同时不仅需要通过对多个群体进行全基因组检测，还需要对环境暴露、基因组内及基因组间的信号通路进行探讨。单核苷酸多态性对POI的影响有限，不同基因之间存在协同、拮抗等作用，因此个性化基因组检测要考虑到卵巢发育不同阶段关键基因的高度遗传异质性、家族谱系和功能等方面，以预测妇女的生殖寿命。了解POI发病机制，可以为临床高危人群提供产前咨询及优生优育的理论基础，为潜在患病风险女性提供生育指导及把握生育力保护时机，如指导卵巢组织、卵母细胞冻存或胚胎冻存，或使用IVA、干细胞治疗等方式提早进行个性化治疗预防或延缓POI的发生。