双特异性磷酸酶在非酒精性脂肪性肝病中的研究进展

辛鑫 胡义扬 冯琴

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发病率快速增长，已成为我国最为常见的慢性肝脏疾病，但相关发病机制尚未完全阐明。双特异性磷酸酶(dual specificity phosphatase, DUSP)是近十年发现的一类酪氨酸特异性的磷酸酶[1]。近期研究证实，DUSP家族成员可通过调节p38丝裂酶原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)p38和c-jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化对NAFLD发生发展起到重要的调节作用。本文就目前DUSP家族在NAFLD领域的研究进展作一综述。

一、DUSP概述

(一)概念及亚型 双特异性磷酸酶(dual specificity phosphatase, DUSP)亦称丝裂酶原活化蛋白激酶磷酸酶(mitogen-activated protein kinase phosphatases, MKPS)是一组既可以使酪氨酸残基去磷酸化，又可使丝氨酸/苏氨酸残基去磷酸的酶分子[1]。由N-末端非催化结构域和C-末端催化磷酸化结构域组成[2]。目前发现的在哺乳类细胞中DUSP基因编码的蛋白大约有30种，它们可与丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)特异性识别并使其去磷酸化[3]。基于序列同系性、亚细胞定位及去磷酸化底物的不同，可将双特异性蛋白磷酸酶 (DUSPs/MKPs) 分为3个亚组: (1)位于细胞核，受应激或丝裂酶原诱导活化：DUSP1/MKP1，DUSP4/ MKP2、DUSP2/PAC1和DUSP5等；(2)位于细胞质且选择性作用于细胞外调节蛋白激酶(ERK)：DUSP6/MKP3和DUSP7/MKPX等；(3)位于细胞核及胞质中，且选择作用于c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK) 和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)：DUSP8、DUSP9/MKP4、DUSP10/ MKP5 和 DUSP16/MKP7等。

(二)生物学功能 目前报道的DUSP生物学功能主要通过调控MAPK去磷酸化水平，负调控MAPK信号通路而实现[4]。有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)是一族在真核生物中非常保守的丝苏氨酸蛋白激酶，在许多细胞活动中起作用，如生长增殖，细胞分化，细胞运动或死亡。MAPK级联信号传导由3个不同层次的分子所组成。MAPK被MAPK的激酶(MAPKK)酸化后激活， MAPKK被MAPKK的激酶(MAPKKK)磷酸化而激活。目前已发现 MAPK 主要有3种亚型: 细胞外信号调节蛋白激酶1、2( ERK1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)。通常认为 ERK1 /2主要参与细胞的增殖和分化, 而 p38MAPK 及 JNK 主要参与细胞的应激反应、代谢和凋亡。

MAPK激酶的活化程度、持续时间以及下游信号传导的调节主要取决于MAPK的去磷酸化水平。DUSP家族可以与MAPK激酶特异性识别结合进而去磷酸化，其主要是通过N-末端区域包含的保守的调控序列, 即激酶相互作用基序 (kinase interaction motif, KIM) , 介导不同MAPK底物(ERK1/2、p38和JNK)的识别和结合，并通过核定位信号(NLS)或细胞核输出信号(NES)决定其亚细胞定位。C-末端区域包含高度保守的蛋白酪氨酸磷酸酶活化位点序列 (I/V) HCXAGXXR (S/T/G) 。当DUSP通过KIM与MAPK结合后, C-末端催化区域活化位点残基出现变构重组, 去磷酸化能力增加，将MAPK位于活化环 (T-loop) 中保守的T-X-Y基序苏氨酸和酪氨酸残基失去, 使MAPK激酶失活。

二、非酒精性脂肪性肝病

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是目前临床上常见的肝脏疾病之一。其疾病谱包含非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝纤维化及非酒精性脂肪性肝硬化。在过去的20年里，NAFLD发病率高速增长，现已成为西方国家中最为常见的肝脏疾病。在我国，由于生活习惯与饮食结构改变，肥胖人群增加，NAFLD 患病率同样进入一个快速增长期。

NAFLD发病与遗传、代谢、应激、生活习惯等有关，Day提出的“二次打击”学说目前得到大家的公认[6]。胰岛素抵抗导致脂质在肝脏中的异常沉积形成“首次打击”；各种原因造成的氧化应激与脂质过氧化损伤，使机体大量释放炎症因子、脂肪因子等参与应激反应，从而造成对肝脏的“二次打击”。 MAPK信号通路参与了NAFLD发病的两次打击的过程。在“首次打击”中，JNK两个亚型JNK1与JNK2在激活后可抑制肝脏胰岛素受体底物1、2(IRS-1/2)的磷酸化，阻止胰岛素与胰岛素受体的结合，从而加剧胰岛素抵抗，促进肝脏脂肪的从头合成及游离脂肪酸向肝脏的流动，最终加剧肝脏脂肪变性[7]；p38激酶在NAFLD发病过程中通过增加磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate car- boxykinase，PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酯酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)磷酸化表达促进肝脏糖异生进程，使机体血糖水平升高，最后导致IR发生[8]。在“二次打击”中，JNK间接激活天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-8，Caspase-8)及激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)转录介导氧化应激和促炎细胞因子对肝细胞炎性损伤[9]。

三、DUSP在NAFLD发病中的作用

随着DUSP家族对MAPK激酶的调节作用逐渐被揭示，不同亚型DUSP在NAFLD发病过程中的作用被多项研究证实，下面将一一进行介绍。

(一)DUSP1与NAFLD 双特异性磷酸酶1(dual specificity phosphatase-1，DUSP1)，也称为丝裂酶元活化蛋白激酶磷酸酶1(MKP-1)，其cDNA(complementary DNA)片段全长为1101bp，可编码367个氨基酸，是Alessi等发现的首个MKP磷酸酶家族成员[10]。DUSP1主要分布于全身组织的细胞核中，对MAPK激酶中的JNK、p38和ERK有特异性去磷酸化底物偏好。最近研究发现在非酒精性脂肪肝的疾病背景下，肝特异性敲除DUSP1与全身敲除DUSP1的小鼠的肝脏糖脂代谢表现不尽相同[11-12]。全身性敲除DUSP1的小鼠给予HFD饮食诱导后，虽然肝脏JNK，p38和ERK活性均显著升高，但肝脏甘油三酯含量相比较于正常小鼠未明显升高，体质量无显著增加，体内糖代谢稳态也未产生明显紊乱[10]。不同的是，肝特异性敲除DUSP1小鼠给予HFD饮食诱导后，伴随肝脏JNK与p38活性升高，小鼠肝脏甘油三酯含量升高，体质量增加并同时伴有糖代谢的紊乱[12]。

(二)DUSP9与NAFLD 双特异性磷酸酶9(dual specificity phosphatase-9，DUSP9)，也称为丝裂酶元活化蛋白激酶磷酸酶4(MKP-4)。其cDNA全长8884bp，由Muda等在1997年首次发现[13]。DUSP9主要分布于肝脏、肾脏、胎盘的细胞质中，对ERK、JNK和p38均有底物偏好[14-15]。但DUSP9与DUSP1相比在调控和表达上比较特殊，其通过与KIM相邻的保守丝氨酸残基的磷酸化调控其底物结合[16]。Dickinson等[16]研究发现，DUSP9基因与中国汉族人口较痩人群2型糖尿病高风险相关。在Voight等的全基因组关联研究(GWAS)结果中，检测到糖尿病患者DUSP9基因位点的遗传变异，并将DUSP9作为人类不同种族罹患2型糖尿病的危险因素之一[18-20]。最近YE等团队发现在高脂饮食喂养小鼠肝脏组织中DUSP9蛋白表达明显低于野生小鼠，随后研究者给肝脏特异性DUSP9基因敲除(DUSP9-CKO)小鼠和肝脏DUSP9基因过表达小鼠给予高脂饲料喂养，结果显示在高脂饮食饲养条件下，DUSP9-CKO小鼠肝脏重量、甘油三酯含量较正常小鼠显著升高，肝脏脂肪变性、胰岛素抵抗和炎性细胞浸润程度也更加严重。而这些肝脏病理表现在DUSP9过表达小鼠中却没有出现。该团队又对高脂高胆固醇饲料喂养的NASH伴肝纤维化小鼠模型进行肝特异性DUSP9基因敲除和过表达，发现基因敲除小鼠肝脏不仅出现了脂肪变性，胰岛素抵抗和炎症，还出现了严重的肝纤维化，而基因过表达小鼠这些病理表现均未出现。进一步机制研究发现DUSP9通过抑制肝细胞凋亡信号调节激酶1(Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)降低肝脏p38和JNK的磷酸化水平，从而改善NASH的进展[21]。

(三)DUSP12与NAFLD 双特异性磷酸酶12(dual specificity phosphatase-12，DUSP12)，是1999年发现的非典型DUSP家族成员之一，其虽然不含碱性氨基酸形成的激酶结合序列或激酶互作序列，但仍具有与MAPK磷酸酶相同的生物学作用，其编码含有340个氨基酸的蛋白质。DUSP12在人体主要脏器中均有表达，其对JNK和p38均有底物偏好。目前DUSP12细胞内定位仍有争议，在不同的细胞或组织中可分别定位与细胞浆或细胞核内[22]。目前关于DUSP12的相关研究较少，与肝脏相关的研究主要集中在与糖代谢的关系上。在肝细胞中，DUSP12可通过使葡萄糖激酶去磷酸化，从而促进糖酵解及糖的有氧氧化[23]。Huang等团队发现，喂养高脂饮食的小鼠肝脏中DUSP12的表达与正常饮食相比显著降低，且在肝特异性DUSP12敲除小鼠表现出肝脂肪变性、胰岛素抵抗和炎症反应。而喂养高脂饮食的DUSP12过表达小鼠肝脏脂肪变性和胰岛素敏感性有所改善。进一步研究发现DUSP12影响NAFLD发病进展的机制与DUSP9类似，主要通过调节肝细胞ASK1磷酸化水平实现[24]。

(四)DUSP14与NAFLD 双特异性磷酸酶14(dual specificity phosphatase-14，DUSP1)，是双特异性磷酸酶家族的非典型成员[4]。DUSP14其底物偏好包含ERK、JNK和p38[25]，被证实在细胞增殖和凋亡中存在反馈调节作用。研究发现其在大鼠胰高血糖素样肽-1(GLP-1)信号通路中对胰腺B细胞增殖和成熟具有负反馈调节的作用[26]。由于MAPK信号通路中的p38和JNK已被证明是胰岛素信号转导的有效调节剂，因此有研究者对DUSP14在肝脂肪变性和相关代谢紊乱中的作用进行探究。Wang等团队对高脂饮食小鼠的肝组织DUSP14表达情况进行观察，发现在高脂饮食小鼠肝组织中DUSP14的蛋白表达远远低于正常小鼠，DUSP14肝特异性敲除小鼠出现严重的肝脂肪变性、胰岛素抵抗以及肝脏炎症反应，但过表达DUSP14的小鼠这些病理表现显著减轻。进一步研究发现DUSP14可与TGF-β激活激酶1(TAK1)直接相互作用，并抑制肝细胞TAK1磷酸化及JNK和p38磷酸化水平，进而改善NAFLD疾病进展[27]。

(五)DUSP26与NAFLD 双特异性磷酸酶26(dual specificity phosphatase-26，DUSP26)作为一种该家族中的一种小型磷酸酶，该基因可编码211个氨基酸的蛋白质，其底物偏好为ERK、JNK和p38。其首次发现于神经内分泌细胞和组织中，在人类癌症中具有促癌和抗癌双重作用，研究者发现其可通过减弱神经生长因子和表皮生长因子的信号传导来参与PC12大鼠细胞瘤细胞分化的过程[28-29]。基于DUSP26在MAPK通路中的作用，结合DUSP1、DUSP9等家族成员在非酒精性脂肪肝病及相关代谢综合征疾病的表现，Ye等学者对其在NAFLD中的作用进行探究[30]。Ye的研究结果发现，在NAFLD小鼠和ob/ob小鼠的肝组织中，DUSP26的表达相较于对照小鼠显著降低，表明该基因在NAFLD相关疾病发病中具有重要作用。研究者随后对高脂饮食诱导的肝特异性敲除DUSP26基因小鼠(DUSP26-LKO)及肝特异性过表达DUSP26基因小鼠(DUSP26-LTG)进行观察。在DUSP26-LKO中，小鼠肝脂肪变性、炎症反应、胰岛素抵抗及肝纤维化程度显著加剧。在DUSP26-LTG小鼠中肝脏脂肪变性等显著改善。进一步研究发现，与DUSP14相似，DUSP26与TAK1特异性结合阻断肝细胞TAK1的磷酸化，进而调节了TAK1-p38和TAK1-JNK的信号传导，从而减轻了肝脂肪变性和代谢紊乱。研究揭示了DUSP26在NAFLD疾病中的积极作用[30]。

四、总结与展望

在NAFLD发病机制中，MAPK家族的作用越来越多地被揭示。JNK和p38-MAPK已被证明是NAFLD发病中胰岛素信号转导、糖脂代谢以及炎症反应的重要调控因子。DUSP1、DUSP9、DUSP12、DUSP14和DUSP26显示对这两个激酶的底物偏好，它们可通过直接调节MAPK的磷酸化水平缓解实验性NAFLD肝细胞脂肪变性、炎症、胰岛素抵抗以及肝纤维化。除直接调控之外，有研究证实部分DUSP亚型对MAPKKK激酶ASK1和TAK1同样具有去磷酸化作用，通过抑制ASK1或TAK1磷酸化从而调节JNK和p38的磷酸化水平。在对DUSP9和DUSP12的研究中，研究者发现它们通过抑制ASK1磷酸化进而调控下游靶点治疗NAFLD。在DUSP14和DUSP26中，调控TAK1的去磷酸化被证实是它们的主要作用机制。

综上所述，目前多个研究报道了多个亚型DUSP参与了NAFLD发生发展，证实了其在NAFLD发病中的重要意义。但是目前这些研究均尚处于动物和细胞研究阶段，至于DUSP能否成为未来NAFLD药物治疗的新靶点，需要进一步机制研究以及相关临床试验来证实。