卵巢癌生物标志物及早期诊断的研究进展

辛玉琦，巨宇叶，王晓慧

卵巢癌是威胁全球女性健康的第五大常见肿瘤，常发生于更年期女性，近年来卵巢癌的发生呈年轻化趋势。由于没有明显的早期症状，且缺乏有效的早期诊断手段，卵巢癌的发病率逐年上升，其死亡率居妇科肿瘤的首位。卵巢癌筛查方法主要有经阴道超声、血清糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）等传统肿瘤标志物，但这些方法有一定的临床应用局限性。基因芯片、蛋白质组学、免疫组织化学等方法逐渐成为卵巢癌早期诊断的研究热点。但由于病理类型多样，机制及病因尚不明确，目前尚无理想的高敏感度、高特异度的生物标志物可应用于临床卵巢癌的早期诊断。因此，寻找可靠的生物标志物对卵巢癌的早期诊断、早期治疗具有重要意义，可以进一步提高女性的生活质量及卵巢癌患者的预后[1]。随着肿瘤分子生物学的发展和对卵巢癌生物学行为的进一步研究，微小 RNA（microRNA，miRNA）、长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）及环状RNA（circular RNA，circRNA）在卵巢癌发生、发展中扮演着越来越重要的角色。现对卵巢癌的相关生物标志物的研究现状及进展进行综述，以期为卵巢癌的早期诊断找到敏感度、特异度较好的标志物。

1 传统的肿瘤标志物

CA125也称癌抗原125，是一种高分子黏液型糖蛋白，由MUC16基因编码产生，与细胞膜相关。其由一个高度O-糖基化的N端区、一个串联重复区和一个C端结构域组成。CA125是一种在上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）患者血清中常见的肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen，TSA）。其在几乎所有上皮性卵巢肿瘤细胞膜和其他肿瘤的亚群中也是过表达的[2]。研究发现1%的正常女性CA125升高，而6%的良性疾病患者和28%的非妇科肿瘤患者CA125水平升高。相比之下，在非黏液性卵巢癌患者中，CA125升高的比例超过80%。临床上以35 U/mL为基线，曾将CA125广泛应用于卵巢癌患者的筛查。然而该标志物在卵巢癌早期的敏感度较低，且月经、妊娠、子宫内膜异位症和腹膜炎症性疾病等生理或病理状态也可导致血清CA125水平升高[3]。因此，CA125并不是诊断及筛查卵巢癌较为理想的生物标志物，现临床上将血清CA125水平更多应用于鉴别卵巢囊肿的良恶性。随后有学者提出，CA125联合人附睾蛋白4（humanepididymisprotein4，HE4）等标志物可能增加早期卵巢癌检测的特异度和敏感度。Guo等[4]的Meta分析表明，血清CA125、CA19-9和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）联合检测是一种有潜力的诊断卵巢癌的生物标志物组合，可提高卵巢癌诊断的敏感度和特异度，敏感度和特异度分别为90%和83%。Xi等[5]研究发现，CA125、HE4和胸腺嘧啶核苷激酶 1（thymidine kinase 1，TK1）联合检测卵巢癌的敏感度和特异度分别为94.18%和79.53%，其敏感度显著高于单一肿瘤标志物或任意2种肿瘤标志物联合检测的敏感度，有利于早期卵巢癌的筛查。但现在仍未发现可最大程度地同时提高敏感度及特异度的标志物组合，其中一个可能的原因是由于肝网状内皮系统快速清除黏蛋白片段，导致这些标志物的血清水平发生异常改变，导致敏感度和特异度降低[3]。因此，探究较CA125敏感度、特异度更高的生物标志物及最佳的联合检测模式对卵巢癌的早期诊断、早期治疗具有极其重要的意义。

近年来，HE4成为卵巢癌辅助诊断的研究热点。HE4是由上皮细胞分泌的一种20～25 ku蛋白，属于乳清酸性四硫化核蛋白（whey acid four-disulfide core，WFDC）家族。2003 年 Hellström 等[6]发现 HE4作为一种分泌型糖蛋白在EOC中过表达，首次证明了血清HE4蛋白水平具有作为卵巢癌生物标志物的潜力。HE4的表达在不同类型卵巢癌组织及同一类型不同期别的卵巢癌组织中有显著差异，HE4在浆液性卵巢癌的阳性表达率（100%）高于黏液性卵巢癌（66.67%），在卵巢子宫内膜样腺癌（100%）、透明细胞癌（66.7%）和无性细胞瘤（75%）中表达率适中或高表达，在卵黄囊肿瘤（25%）中表达率较低；HE4在早期卵巢恶性肿瘤（Ⅰ/Ⅱ期）中的表达率（66.67%）低于晚期（Ⅲ/Ⅳ期，97.22%）；高度分化的卵巢癌组织HE4阳性表达率（37.50%）低于低分化组织（92.00%）；在未转移患者的阳性表达率（35.57%）低于转移者（100%）[7]。研究证实，HE4在EOC早期阶段比CA125具有更高的敏感度和特异度。最近的一项Meta分析表明，HE4检测交界性或恶性卵巢肿瘤的总敏感度为78%（95%CI：72%～83%），特异度为 86%（95%CI：84%～87%）；在绝经前妇女中，HE4检测交界性或恶性卵巢肿瘤的敏感度为 71%（95%CI：65%～77%），特异度为 88.0%（95%CI：86%～90%）；在绝经后妇女中，HE4检测交界性或恶性卵巢肿瘤的总敏感度为77%（95%CI：72%～81%），特异度为 91%（95%CI：89%～94%）；在早期卵巢癌中，总敏感度为 64%（95%CI：61%～70%），特异度为 87%（95%CI：85%～89%），高于文献报道的CA125检测早期卵巢癌的敏感度（45.9%）；在晚期卵巢癌中，总敏感度为 89%（95%CI：82%～92%），特异度为86%（95%CI：84%～88%）[8]。提示HE4是诊断早期卵巢癌的重要肿瘤标志物。Furrer等[9]对177例EOC女性进行外部验证研究，277 pmol/L被确定为HE4的最佳截断值，术前血浆HE4水平高于277 pmol/L的EOC女性死亡风险明显更高，这种联系在浆液性EOC亚组中最强。提示术前血浆HE4可以作为EOC患者尤其是浆液性EOC肿瘤患者潜在的预后生物标志物。腹水HE4水平还可评价卵巢癌化疗疗效，高水平的HE4可能预示着有化疗耐药和腹水形成的可能[10]。监测卵巢癌合并腹水患者血清和腹水中HE4的表达水平，对指导和改进治疗方案具有重要意义。HE4在卵巢癌的早期诊断及鉴别中具有重要的临床意义，且在预测EOC患者预后等方面明显优于CA125，目前临床上更多用CA125联合HE4预测卵巢肿瘤为恶性的风险。

还有其他肿瘤标志物可用于卵巢癌的早期诊断。间皮素（mesothelin，MSLN）是一种糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidyl inositol，GPI）锚定的膜糖蛋白，在胸膜、心包和腹膜的间皮细胞表面生理性表达。Wu等[11]研究显示，EOC患者的MSLN水平明显高于良性卵巢囊肿患者和健康志愿者，且术后MSLN水平显著下降，其水平还与EOC患者的国际妇产科联盟（FIGO）手术病理分期、病理分级和疾病进展有关，晚期低分化卵巢癌患者MSLN水平较高，提示预后不良。由SEPT9基因编码的septin-9蛋白在EOC患者血浆中异常升高，可作为卵巢癌早期诊断的外周血肿瘤标志物，其受试者工作特征曲线（ROC曲线）下面积（AUC）为0.712，最佳截断值为0.28，敏感度为82.5%，特异度为50.0%，且septin-9蛋白水平还与EOC的远端转移和预后有关[12]。提示MSLN及septin-9蛋白可用于卵巢癌的早期诊断及疾病进展的监测。1998年Xu等[13]首次报道了卵巢癌患者血浆溶血磷脂酸（LPA）水平较良性妇科疾病患者或健康对照者升高，说明LPA可作为卵巢癌另一种潜在的标志物。然而LPA是一种动态分子，其含量随环境的变化而变化，在健康女性和良性妇科疾病患者中也可检测到LPA的非特异性升高，易增加假阳性结果[14]，因此，LPA在卵巢癌诊断方面的作用还需进一步研究。基于蛋白质组学及生物信息学的迅速发展，新的卵巢癌肿瘤标志物正逐渐被发现并深入挖掘，为卵巢癌的早期诊断提供了巨大的希望。

2 lncRNA

lncRNA是一类长度大于200 nt的非蛋白编码RNA，是20世纪末被研究发现的转录本。lncRNA既往被认为是转录噪声，现发现其在多种生理和病理过程中发挥重要作用[15]，尤其是在恶性肿瘤中，lncRNA能够通过调节染色质重构、转录和选择性剪接以及产生miRNA或短的生物活性肽等多个水平调控基因表达，发挥致癌或抑癌的作用[16]。因此，功能lncRNA可能成为卵巢癌诊断和预后判断的新靶点。

HOX基因座转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）被认为是多种癌症的原癌基因，是一种具有调控转录活性的lncRNA。Dong等[17]研究发现HOTAIR在卵巢癌细胞，尤其是SKOV3细胞系中表达显著增加，下调HOTAIR的表达时，磷脂酰肌醇3激酶调节亚基3（PIK3R3）的mRNA和蛋白水平下降，可降低SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。说明HOTAIR作为一种竞争性内源RNA（ceRNA），可通过调控PIK3R3促进卵巢癌SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭。CCND1和CCND2是人类常见的癌症启动子，其上调与晚期肿瘤和肿瘤转移有关[18]。Chang等[19]研究显示HOTAIR可通过ceRNA调控网络使miR-216表达降低，正向刺激CCND1和CCND2表达，从而促进卵巢癌细胞增殖、细胞周期进展、迁移和侵袭。HOTAIR在卵巢癌组织中的高表达及其对卵巢癌细胞的作用使其成为早期诊断卵巢癌的潜在生物标志物之一。

分化拮抗非蛋白编码RNA（DANCR）是一种新发现的致癌lncRNA。Gao等[20]采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测了52例卵巢癌组织标本和4个卵巢癌细胞系中DANCR的表达水平，结果显示，DANCR在卵巢癌组织中显著上调；此外，Transwell分析还表明DANCR过度表达促进了卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，这一过程可能通过上调胰岛素样生长因子2（IGF2）蛋白表达实现。另有研究证明DANCR还可通过调控miR-145/血管内皮生长因子（VEGF）轴在卵巢癌血管生成中发挥促进作用[21]。上述结果提示，DANCR可作为候选靶点，有助于卵巢癌的早期诊断及治疗。

还有很多其他lncRNA在卵巢癌组织中表达升高或降低，且在不同分子机制水平影响卵巢癌的发生和发展。例如，PTAR通过竞争性结合miR-101-3p调控ZEB1的表达，促进浆液性卵巢癌上皮间质转化（EMT）和侵袭、转移[22]。MALAT1通过磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）通路促进EOC的增殖和转移[23]。MEG3可通过调控卵巢癌细胞下游基因第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因（PTEN），抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，阻断细胞周期进展，而MEG3在卵巢癌组织中的表达较正常卵巢组织降低[24]。还有几种lncRNA的存在与EOC的不同亚型相关。例如Casc2和FLJ33360可以将浆液性卵巢癌与其他亚型区分开来[25-26]，SNHG15将低级别浆液性卵巢癌、黏液性卵巢癌和卵巢透明细胞癌与高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）、子宫内膜样卵巢癌和卵巢未分化细胞癌区分开来[27]。这些lncRNA都可为寻找卵巢癌早期诊断的生物标志物提供依据。

上述研究表明lncRNA参与卵巢癌发生、发展，有望成为卵巢癌早期诊断、治疗及预测预后的重要靶标，然而其实际临床应用还未得到有效验证，相信随着研究的深入及临床检测手段的提高，lncRNA对于卵巢癌的早期诊断将会有很大突破。

3 miRNA

miRNA是一种小的、内源性表达的单链非编码RNA，长度约19～25nt，在细胞核中由DNA聚合酶Ⅱ合成，其通过抑制靶基因的翻译或降解靶mRNAs来调节细胞中的基因表达[28]。早期研究显示，存在于人类血浆中的miRNA具有非常稳定的形态，能够保护其不受内源性RNA酶活性的影响，而且即使在极端高温、pH值、长期储存等恶劣环境下，miRNA也能保持稳定[29]。miRNA在任何疾病，尤其在肿瘤中都有特异性的上调或下调，近年研究发现miRNA也参与卵巢癌的发生、发展。miRNA的这种稳定性和特异性使得循环miRNA成为卵巢癌新的生物标志物，可成为早期诊断及治疗的新靶点。

Oliveira等[30]通过qRT-PCR检测发现了4种（miR-200c-3p、miR-221-3p、miR-21-5p 和 miR-484）上调和 2种（miR-195-5p和 miR-451a） 下调的miRNA。研究还在验证队列中进一步证实了miR-200c-3p、miR-221-3p联合CA125检测可提高卵巢癌的早期诊断准确性（AUC为0.96）。提示卵巢癌组织中上调的miRNA可作为早期诊断的标志物，而下调的miRNA可为其治疗等提供依据。此外，还有研究发现尿液中的miRNA在卵巢癌的诊断中也具有重要意义。miRNA芯片数据显示，与良性妇科疾病患者和健康对照者相比，miR-30a-5p在卵巢浆液性腺癌患者尿液中的表达明显上调。研究人员还检测了肿瘤切除患者尿液中的miRNA表达，结果显示，miR-30a-5p的表达显著降低，提示尿miR-30a-5p可能来源于卵巢浆液性腺癌细胞[31]。因此，尿液中miR-30a-5p的表达水平可作为诊断卵巢浆液性腺癌的重要依据。

上述研究均评估了卵巢癌的miRNA表达谱，证实了miRNA在卵巢癌诊断中的潜在作用。近年的荟萃分析也说明了miRNA对于卵巢癌诊断的临床意义，研究者采用稳健秩聚集（RRA）方法对miRNA的表达特征进行了综合分析，发现miR-200a-3p（总敏感度为84%，特异度为83%）和miR-200c-3p（总敏感度为75%，特异度为66%）对EOC具有可靠的诊断能力，深入分析研究提示miR-200a、miR-200ac可能通过影响细胞黏附过程促进EOC进展[32]。miRNA作为卵巢癌较好的生物标志物，今后有望应用于临床卵巢癌的早期诊断。

4 circRNA

circRNA是一种单链、共价封闭的RNA分子，通常起源于前体mRNA的头尾反向剪接，其中5′和3′端共价连接并形成环状结构[33]。最早于1976年在病毒中作为类病毒被发现，当时circRNA被认为是错误的剪接[34]。21世纪随着RNA测序（RNA-seq）技术和生物信息学的发展，揭示了circRNA在不同发育阶段和生理状态下的动态表达模式。最近的研究表明，circRNA可能参与miRNA抑制、EMT和肿瘤的发生[35]。随着检测和表征方法的改进，circRNA可能成为潜在的生物标志物或治疗靶点。

Teng等[36]通过RNA测序总共鉴定出7 333个circRNA，其中分别有2 431和3 120个circRNA在EOC中明显上调和下调，circHIPK3是测序数据中表达最丰富的circRNA，qRT-PCR检测显示，circHIPK3在正常卵巢细胞中的表达高于卵巢癌细胞系；进一步研究发现，沉默circHIPK3可通过circHIPK3-miRNA-mRNA轴显著促进卵巢癌细胞的增殖、迁移与侵袭。Fan等[37]使用TaqMan定量PCR检测了36例卵巢癌患者和36例正常对照者血清样本中circMAN1A2的表达，发现circMAN1A2在卵巢癌患者的血清中显著高表达。通过ROC曲线分析，在卵巢癌中circMAN1A2的AUC为0.694，说明circMAN1A2对卵巢癌的早期诊断具有临床应用价值。然而该研究的局限性在于样本量小，用于分析的成对卵巢组织少于50个，有必要扩大样本量，以验证circRNA作为诊断卵巢癌生物标志物的有效性。Hu等[38]采用qRT-PCR和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测发现circBNC2在EOC中显著下调，与HE4（区分EOC与良性卵巢肿瘤或健康人群的AUC分别为0.742、0.779）和 CA125（AUC 分别为 0.373、0.713）相比，其在区分EOC与良性卵巢囊肿（AUC为0.879）或健康人群（AUC为0.923）时AUC最高；在区分EOC和良性卵巢肿瘤中，circBNC2的敏感度和特异度最高（分别为96.4%、80.7%），其次为HE4（分别为80.7%、47.0%）和 CA125（分别为 24.1%、66.3%）；在区分EOC和健康人群中，circBNC2的敏感度最高（95.2%），其次为 HE4（80.7%）和 CA125（24.1%），circBNC2（85.5%）和 CA125（91.6%）的特异度优于HE4（55.4%）。此外，该研究还评估了circBNC2对肿瘤分期的临床价值，circBNC2可以区分早期EOC与良性卵巢肿瘤（AUC为0.864，敏感度92.0%，特异度80.7%）和健康人群（AUC为0.908，敏感度92.0%，特异度85.5%）。circBNC2在EOC组织和血浆样本中表达下调，可能成为EOC早期诊断的生物标志物。Chen等[39]研究发现circ-ABCB10在EOC中较癌旁组织表达上调，其AUC为0.766，且circ-ABCB10的高表达与分化差、肿瘤体积大、FIGO分期高和总生存期较差有关。

Ning等[40]通过对4对匹配的EOC和正常卵巢组织的circRNA测序分析和qRT-PCR验证发现，6种 circRNA （circBNC2、circEXOC6B、circFAM13B、circN4BP2L2、circRHOBTB3 和 circCELSR1）与 EOC的各种临床病理特征相关，而且circEXOC6B和circN4BP2L2可能成为新的诊断EOC的生物标志物。最近，Gao等[41]采用高通量测序研究首次发现circRNA在HGSOC中的差异表达谱，共354个circRNA表达上调，356个circRNA表达下调；qRT-PCR证实在 HGSOC 组织中，circRNA385、circRNA2058、circRNA3336、circRNA2606和 circRNA1656表达下调，circRNA1312和circRNA7474表达上调，其中circRNA1656的差异表达程度最高，且与HGSOC FIGO分期显著相关，有望成为诊断HGSOC新的肿瘤标志物。circRNA在卵巢癌早期诊断中以其高度的特异性及稳定性优势发挥重要作用，受到越来越多科研工作者的关注。

5 结语

迄今为止，卵巢癌的早期诊断仍然是一个难以达到的目标，早期诊断对于卵巢癌患者的早期治疗及预后改善都有极其重要的临床意义。肿瘤标志物作为无创检测手段，具有简便、快捷等优势，但其敏感度和特异度还有待进一步提高。随着科学技术的提高，非编码RNA在卵巢癌发生、发展中的作用及其分子机制的研究取得了快速进展，成为早期诊断卵巢癌的潜在生物标志物。综述早期诊断卵巢癌的生物标志物可帮助医生和患者选择最佳的卵巢癌诊断方法，为卵巢癌肿瘤标志物的联合检测提供参考依据，希望有助于提高卵巢癌的诊断率及治愈率。