双响应面法结合Matlab法优化葡萄籽多酚提取工艺及羟自由基清除率评价

薛 山,2,肖 夏3,陈舒怡,刘伯虎,兰国锦

(1.闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州 363000; 2.菌物产业福建省高校工程研究中心,福建漳州 363000; 3.四川理工学院生物工程学院,四川自贡 643000)

葡萄是世界范围内种植及销量最大的水果之一,其营养丰富、生物活性高,其中约13%用于鲜食,80%用于酿酒,7%用于其它副产品加工[1]。以葡萄酒酿造为例,加工之后会产生大量的葡萄皮渣、葡萄籽、以及葡萄梗,可占据酿酒葡萄总量的20%[2]。其中,葡萄籽提取物(Grape seed extract,GSE)中含有丰富的多酚类、矿质元素、蛋白质、氨基酸、维生素等,具有潜在的开发价值[3-4]。据报道,葡萄籽中的活性多酚现已应用于食品、药品和保健品[1]。与此同时,葡萄籽多酚的提取利用还有利于实现废弃物综合利用,减少环境污染[5-6]。

目前,葡萄皮渣中多酚的提取虽已有多种方法,如酶法、超声辅助法、溶剂萃取法等[7],但考虑到扩大生产规模的局限性仍多采用溶剂提取法[8]。同时,诸多研究显示,在有机试剂中,丙酮有着较高的葡萄籽多酚(grape seed polyphenols,GSP)提取率,且丙酮提得的GSP具有较优的抗氧化活性[8-10]。经成分鉴定,葡萄籽中含有没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素等活性酚类[11-13],具有抗氧化[14]、抗肿瘤[15]、抗炎症[16]、保护心脏[17]、降血脂[18]等多种生理功效。

国内外已有不少学者对GSP的提取工艺进行了研究,但是多为仅仅基于酚类物质提取率的单因素及响应面优化[19-20],罕见Matlab的优化研究。Matlab是国际上最优秀的科技应用软件之一,具有强大的科学计算功能,并提供了专门的优化工具箱,通过建立研究问题的数学模型,编写程序代码,有效计算出最优解,已广泛应用于各研究领域[21],如化工油脂提取优化[22],本文拟采用Box-Behnken双响应面优化法结合Matlab分析法对GSP进行提取工艺优化,拟为葡萄籽的加工利用研究提供理论依据与创新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿酒新疆山葡萄籽(干品) 大闽食品(漳州)有限公司提供;甲醇、无水乙醇、丙酮、无水碳酸钠、没食子酸标准品 分析纯,西陇科学股份有限公司;福林酚试剂 北京索宝生物科技有限公司。

AR124CN电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司;DGG-9140B电热鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;FW100高速万能粉粹机 天津市泰斯特仪器有限公司;HH-2数显电子恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;TGL-20M台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;UV5100B紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 GSP的提取 将葡萄籽粉碎,过40目筛,用石油醚脱脂后,自然挥干溶剂,于4 ℃冷藏备用。准确称取1.00 g样品于100 mL离心管中,按照一定的料液比加入适量体积的溶剂,于冰浴1000 W的超声波发生仪超声一定时间,之后激烈搅拌提取一定时间。然后在2500×g下离心10 min,收集上清液,残渣重复提取一次,合并上清液并在45 ℃下旋转浓缩到合适体积,用蒸馏水定容于25 mL待测[23]。

1.2.2 GSP含量测定 采用福林酚比色法,参考梁强[24]和Chu等[25]方法。在10 mL试管中,加入0.2 mL的多酚样品提取液,用0.8 mL的蒸馏水稀释,随后加入0.2 mL的福林酚试剂,混合均匀。放置6 min后,加入2 mL 7%的碳酸钠溶液,最后用蒸馏水补足5 mL,并在室温下反应90 min,于波长760 nm处测定吸光值A。以没食子酸为标准品,用蒸馏水稀释不同浓度后绘制标准曲线,得到回归方程:y=0.093x-0.002,R2=0.9995,y为吸光值,x为标准没食子酸溶液浓度。GSP的提取量用没食子酸当量(gallic acid equivalent,GAE)μg GAE/mg DW表示。

1.2.3 羟自由基清除率测定 在10 mL比色试管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L的水杨酸溶液1.0 mL、待测液1.0 mL,8.8 mmol/L的H2O2溶液1.0 mL,摇匀,37 ℃水浴30 min,于510 nm处测其吸光度,平均值记为Ai。另用蒸馏水代替H2O2溶液重复上述试验,测得参比吸光度Ab;另用蒸馏水代替样品溶液重复上述试验,测得空白吸光度A0[26]。羟自由基清除率按下试计算:

1.2.4 单因素实验 分别以不同提取介质、溶剂浓度、料液比、提取时间为单因素进行实验,探究各因素对GSP提取量和羟自由基清除率的影响。

1.2.4.1 不同提取介质对GSP提取量和羟自由基清除率的影响 称取粉碎过40目筛的脱脂葡萄籽粉1.00 g,料液比1∶30 g/mL,提取时间90 min条件下探究不同提取介质(水、80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮)对GSP提取量和羟自由基清除率的影响。

1.2.4.2 不同浓度溶剂对GSP提取量和羟自由基清除率的影响 称取粉碎过40目筛的脱脂葡萄籽粉1.00 g,提取介质为丙酮,料液比1∶30 g/mL,提取时间90 min条件下探究不同丙酮浓度(60%、70%、80%、90%、100%)对GSP提取量和羟自由基清除率的影响。

1.2.4.3 料液比对GSP提取量和羟自由基清除率的影响 称取粉碎过40目筛的脱脂葡萄籽粉1.00 g,提取介质为80%丙酮,提取时间90 min条件下探究不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)对GSP提取量和羟自由基清除率的影响。

1.2.4.4 提取时间对GSP提取量和羟自由基清除率的影响 称取粉碎过40目筛的脱脂葡萄籽粉1.00 g,提取介质为80%丙酮,料液比1∶40 g/mL条件下探究不同提取时间(30、60、90、120、150 min)对GSP提取量和羟自由基清除率的影响。

1.2.5 响应面试验 根据单因素实验结果,确定提取液为丙酮,根据Box-Behnken设计的自变量,以GSP提取量和羟自由基清除率为双响应值,进行提取条件优化。响应面分析因素和水平表见表1。

表1 响应面分析因素和水平表Table 1 TheTable of factors and levels used in response surface analysis

1.2.6 最优组合验证试验 依据Box-Behnken双响应面结果,得到最优工艺条件,并进行验证试验。

1.2.7 Matlab优化试验设计 利用Matlab软件,采用优化计算方法以及算法语言的图形处理功能,通过编制程序M(程序代码),计算出溶剂浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)对GSP提取量(y1)和羟自由基清除率(y2)的四维及三维交互影响结果。

1.3 数据处理

每组处理重复3次,数据结果用均值±标准差表示。采用SPSS Statistics 24.0软件对结果进行单因素显著性分析,P<0.05表示结果显著,标示为不同字母。利用Design-Expert 8.0.6 Trial软件进行响应面优化实验,利用Matlab(MATrix LABoratory)软件进行交互试验数据计算及四维、三维绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同溶剂对GSP提取量和羟自由基清除率的影响 从图1可知,在相同的提取条件下,80%的丙酮溶液的多酚提取量显著高于其他溶剂(P<0.05),80%乙醇与80%甲醇的提取效果差异不显著(P>0.05),而纯水的多酚提取量最少。从自由基清除率来看,80%丙酮提取物的活性也显著高于其他提取介质组(P<0.05)。据报道,有机溶剂能够较高效的提取黄酮醇类、黄烷-3-醇类、芪类多酚等活性成分[10],其中,丙酮对葡萄籽原花青素的提取效果较甲醇和乙醇更优,且70%丙酮GSP提取物的抗氧化活性最高[8]。据刘进杰等[27]报道,采用甲醇、乙醇、丙酮和酸性水4种溶剂分别提取葡萄皮多酚时,丙酮提取物多酚得率最高、总还原力最强、对DPPH·的清除作用最好。以上结果与本文的研究结论有一致性。

图1 不同提取介质对多酚提取量和自由基清除率的影响Fig.1 Effect of different extraction medium on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols 注:不同小写字母表示多酚含量差异显著(P<0.05), 不同大写字母表示自由基清除率 差异显著(P<0.05);图2～图4同。

2.1.2 不同浓度溶剂对GSP提取量和羟自由基清除率的影响 从图2看出,丙酮浓度对GSP有着较为明显的影响。在60～100%浓度范围内,80%丙酮的多酚提取量最高,抗氧化性也最强。推测其原因,这可能是因为80%丙酮溶液的有机组分更好地提取了黄酮醇类、黄烷-3-醇类、芪类多酚等活性成分,水相部分更优地提取了苯甲酸类和肉桂酸类酚酸[10]。正是因为提取物成分的含量及组成不同,造成了羟自由基清除效果的差异。这也解释了图2中80%与70%浓度丙酮抗氧化性差异不显著(P>0.05),但是前者的多酚含量显著高于后者(P<0.05)的原因。因此，丙酮浓度选择为80%。

图2 不同浓度溶剂对多酚提取量和自由基清除率的影响Fig.2 Effect of different concentrations of solvent on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols

2.1.3 料液比对GSP提取量和羟自由基清除率的影响 从图3可以看出,料液比在1∶10～1∶40 g/mL范围内,GSP的提取量显著升高(P<0.05),在1∶50 g/mL时达到最高值,但是1∶40与1∶50 g/mL时的多酚提取量并无显著性差异(P>0.05),从成本考虑,选用1∶40 g/mL料液比较为合适。从自由基清除率角度来看,其变化趋势与提取量呈现一致性。推测其原因,一方面是因为总多酚的含量多少对抗氧化性有显著影响,另一方面是因为溶剂用量的增加能够促使抗氧化活性强的组分更多地溶出,尤其是在1∶10～1∶40 g/mL用量区间。因此，料液比选择为1∶40 g/mL。

图3 料液比对多酚提取量和自由基清除率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols

2.1.4 提取时间对GSP提取量和羟自由基清除率的影响 从图4看出,相同的提取条件下,随着时间延长,GSP提取量与羟自由基清除率均呈现先升高后降低的趋势,在提取90 min时达到最高点。提取时间较短,多酚溶出量有限,故自由基清除活性较低,但是当提取时间过长,多酚虽然提取较为完全,但是由于氧化等原因难免有所损耗,尤其是强抗氧化活性组分。因此，提取时间选择为90 min。

图4 提取时间对多酚提取量和自由基清除率的影响Fig.4 Effect of time on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols

2.2 双响应面试验结果

2.2.1 双响应面试验结果 在单因素实验基础上,应用Box-Behnken进行了三因素三水平的试验设计。GSP提取量和自由基清除率的双响应面实验结果见表2,回归模型和方差分析结果分别见表3和表4。

表3 基于多酚提取量的方差分析结果Table 3 The variance analysis result based on the extraction amount of polyphenols

注:*P<0. 05,影响显著;**P<0. 01,影响极显著;表4同。

表2 双响应面优化实验设计及结果Table 2 Design and results of response surface optimization experiment

使用Design 8.0. 6对双响应面分析得出y1和y2的回归方程分别为:

y1(GSP提取量)=72.47+1.19A+4.11B+0.68C-2.98AB-0.29AC+0.69BC-3.46A2-1.41B2-6.38C2

式(1)

y2(GSP自由基清除率)=69.48+0.74A+2.43B+0.37C-2.18AB+0.12AC+0.045BC-2.87A2-1.19B2-4.23C2

式(2)

从表3和表4可以看出,以上两个模型均显著(P<0.05),且失拟项不显著(P>0.05),说明模型拟合性均较好[28]。GSP提取量的回归方程决定系数为R2=0.9173,说明响应值的变化有91.73%来源于所选三个变量。同理,多酚自由基清除率的回归方程决定系数为R2=0.8423,说明响应值的变化有84.23%来源于所选三个变量。通过F值可以得出,各因素对多酚提取量和自由基清除率的影响显著性大小均为:料液比>溶剂浓度>提取时间。变异系数C.V.(%)是衡量每个测量平均值偏离真实情况的参数,其值越小,表明重复性越好,两个模型的变异系数分别为3.53%和3.51%,均在可接受范围内,说明该模型的重复性良好[29]。

2.2.2 双响应面图结果 响应面图是响应值在各试验因素交互作用下得到的结果构成的一个三维空间曲面。由图5a可以看出,响应曲面的坡度较抖,说明溶剂浓度与料液比的交互作用对GSP提取量影响显著;溶剂浓度在75～85%范围内,提取时间在75～105 min范围内,多酚提取量先增高后降低(图5b);料液比在1∶35～1∶45 g/mL范围内,提取时间75～105 min范围内,随着料液比的增加,多酚提取量显著升高(图5c)。图5与图6的变化规律非常类似,与表3和表4的分析结果一致。

表4 基于多酚自由基清除率的方差分析结果Table 4 The variance analysis result based on the radical scavenging rate of polyphenols

图5 各因素交互作用对多酚提取量影响的等高线图和响应面图Fig.5 Contour plot and response surface plot of the influence of the interaction of various factors on the extraction amount of polyphenol

图6 各因素交互作用对多酚自由基清除率影响的等高线图和响应面图Fig.6 Contour plots and response surface plots of the effects of the interaction of various factors on the polyphenol radical scavenging rate

图7 基于y1优化的四维交互曲面Fig.7 The 4-D interactive surface based on the optimizing of y1

图8 基于y2优化的四维交互曲面Fig.8 The 4-D interactive surface based on the optimizing of y2

图9 各因素交互作用对多酚提取量及自由基清除率影响的等高线图和响应面图Fig.9 Contour plots and response surface plots of the effects of the interaction of various factors on the extraction amount and radical scavenging rate of polyphenol

2.2.3 双响应面最佳工艺预测及验证试验 通过Design Expert 8.0.6数据分析软件优化,得到最佳提取工艺参数的理论值为丙酮浓度78.7%,料液比1∶45 g/mL,提取时间91.2 min,此时多酚提取量的理论值为75.48 μg GAE/mg DW,自由基清除率理论值为70.90%。经验证,多酚提取量实际值为(75.39±0.10) μg GAE/mg DW,自由基清除率为70.82%±0.11%,与理论值差异不显著(P>0.05),方法可行。

2.3 Matlab试验结果及数据分析

通过编程,得到溶剂浓度(%)、料液比(g/mL)、提取时间(min)对GSP含量和羟自由基清除率的四维效果图(图7、图8)。当GSP提取量(y1)取得理论最大值(75.49 μg GAE/mg DW)时,通过矩阵计算得到丙酮浓度78.67%,料液比1∶45 g/mL,提取时间为91.53 min;同理,当GSP羟自由基清除率(y2)取得理论最大值(70.91%)时,丙酮浓度78.67%,料液比1∶45 g/mL,提取时间为90.92 min。

为了更好地描述分析数据间的交互影响,分别绘制当提取时间短(75 min)、中(90 min)、长(105 min)时,料液比与溶剂浓度对y1、y2交互影响的三维旋转曲面与等高线投影图(图9)。

当提取时间(C)取下限值(C=75 min)时,固定料液比(B),随着溶剂浓度(A)的升高,y1(实线)先增大后减小;固定A值,随着B的升高,y1持续降低。y2(虚线)趋势与y1基本一致。此时,y1取值范围为52.65～67.58 μg GAE/mg DW,y2取值范围为55.64%～66.29%。当料液比为1∶40～1∶45 mL/g,溶剂浓度在75%～83%时,y1和y2可同时取得最大值。

当提取时间(C)取中间值(C=90 min)时,y1和y2的变化趋势与C=75 min时一致。此时,y1取值范围为59.32～75.40 μg GAE/mg DW,y2取值范围为60.08%～70.90%。当料液比为1∶42～1∶45 mL/g,溶剂浓度约76%～82%时,y1和y2可同时取得最大值。

当提取时间(C)取上限值(C=105 min)时,y1和y2的变化趋势与C=75 ℃和90 ℃时一致。此时,y1取值范围为53.22～70.48 μg GAE/mg dw,y2取值范围为56.05%～67.06%。当料液比接近1∶45 mL/g,溶剂浓度约77%～80%时,y1和y2可同时取得最大值。

综上所述,当提取时间取中间值(C=90 min)时,y1和y2均能够取得理论较大值;当丙酮浓度在75%～85%区间,料液比越趋近1∶45 mL/g,y1和y2的值越趋近最大值;与响应面分析结论一致。

3 结论

本研究采用Box-Behnken双响应面优化法结合Matlab分析法对GSP进行提取工艺优化及羟自由基清除率测定,得到最优参数为:丙酮浓度78.7%,料液比1∶45 g/mL,提取时间91.2 min,此时,多酚提取量实际值(y1)为(75.39±0.10) μg GAE/mg DW,自由基清除率(y2)为70.82%±0.11%,均与理论值差异不显著(P>0.05)。此外,经Matlab分析,当提取时间取中间值(C=90 min)时,丙酮浓度处于76%～82%区间,料液比越趋近1∶45 mL/g,y1和y2的值越趋近理论最大值;与最终结论一致。双响应面与Matlab相结合的优化方法,不仅能够准确得到最佳提取方案,也能够更直观的找出合理的工艺参数区间,为葡萄籽工业化加工利用研究提供理论基础与创新依据。