中压快速分离系统大量制备高纯度桑葚和树莓花色苷的工艺研究

杜 霞,周少潼,李春美

(华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070)

桑葚和树莓均属于聚合型浆果,果实柔软多汁,口感酸甜[1],营养丰富,富含矿物质及多酚类物质[2]。成熟桑葚的总花色苷含量可高达185 mg/100 g[3],而树莓中的花色苷含量在400～1230 μg/g之间[4],是制备花色苷的良好原料。研究表明:花色苷可以有效降低冠状动脉硬化、心脏病等发病风险[5]。此外,花色苷还具有抗氧化[6]、抗炎症[7]、调节血脂、降血糖[8-9]等多种健康效应。随着对花色苷研究的进一步深入,对高纯度的花色苷制品需求也越来越大,然而目前市售的花色苷标准品种类单一[10],价格昂贵。因此,建立高效快速制备高纯度花色苷的方法显得尤为重要。

花色苷的分离纯化多采用高速逆流色谱[11]、凝胶色谱[12-14]、半制备高效液相色谱[15]等方法,这些方法多存在耗时长、操作复杂、效率低、成本高、制备量小等问题,使在短时间内快速获得大量高纯度花色苷单体成为难题。中压快速分离系统具有单次上样量大、操作简单、耗时短、效率高、经济效率高等优点[16-18],被广泛应用于天然产物的分离和纯化。目前通过中压快速分离系统可从黑豆皮[19]和黑米[20]等材料中获得较高纯度的矢车菊素-3-葡萄糖苷,但其它结构的花色苷尚无报道。本文利用中压快速分离系统建立了分离桑葚和树莓中3种不同结构花色苷的方法,并用高效液相色谱和质谱对所得的3种花色苷的纯度及结构进行了确认,旨在为花色苷资源的深入研究和开发提供支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红树莓品种为小悟红 购于湖北省孝昌小悟乡冻藏于-20 ℃备用;桑葚 购买于宝桑园健康食品有限公司,冻藏于-20 ℃备用;矢车菊素3-葡萄糖苷 纯度≥95%,上海源叶生物科技有限公司;AB-8大孔吸附树脂 南开大学化工厂;甲醇、乙醇、甲酸、乙酸乙酯 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;浓盐酸、硫酸 分析纯,信阳市化学试剂厂;甲醇、甲酸 色谱级,美国Fisher公司。

ML204电子天平梅特勒-托利多仪器 (上海)有限公司;SKG榨汁机 广东艾诗凯奇智能科技有限公司;Waters C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美国沃特斯公司;高效液相色谱仪 日本岛津公司;数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵、DLSB-5/20低温冷却液循环泵、旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司;LGJ-10真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司;1100 Series LC/MSD Trap液相色谱-质谱联用仪 美国沃特斯公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桑葚和树莓花色苷的提取 分别称取定量的桑葚和树莓果肉打浆,以1∶2的料液比(v/v)加入95%工业甲醇(含0.1%的盐酸),在40 ℃下超声提取30 min,滤渣再次用同样的料液比重复提取3次,合并提取液,利用旋转蒸发仪在45 ℃真空浓缩除去甲醇至无醇味。将上述浓缩液经布氏漏斗抽滤后,pH调至1～2,上样至装填有AB-8大孔树脂填料的层析柱,吸附60 min后,用体积分数为0.1%盐酸去离子水溶液除去糖、蛋白质等杂质,待硫酸-苯酚法[21]检测洗脱液无色,再用pH为2.5的60%乙醇(含0.1%盐酸)洗脱花色苷,收集洗脱液,再次减压浓缩至无醇味。将经过AB-8大孔树脂除杂后的两份浓缩液用等体积的乙酸乙酯萃取三次,去除黄酮类等物质,合并水相,真空浓缩后冻干得到桑葚和树莓两种花色苷粗提物冻藏于-20 ℃备用[22]。

1.2.2 桑葚和树莓花色苷粗提物高效液相检测分析

1.2.2.1 矢车菊素-3-葡萄糖苷标品的分析 方法参考李梦丽[22]并做少许改动,取定量矢车菊素-3-葡萄糖苷标品用甲醇溶液(含有体积分数为0.1%HCl)溶解,配制成一定浓度的矢车菊素-3-葡萄糖苷标准液,再经0.45 μm滤膜过滤到棕色液相小瓶用于液相分析。采用Waters C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流速1 mL/min,流动相A:5%甲酸水,流动相B:甲醇,梯度洗脱条件:0～10 min,5%～20% B;10～15 min,20%～20% B;15～30 min,20%～25% B;30～35 min,25%～25% B;35～40 min,25%～33% B;40～42 min,33%～5% B;42～47 min,5%～5% B;进样量10 μL;PAD检测器;检测波长520 nm。矢车菊素-3-葡萄糖苷标准液0.5、1、2、4、8 μL,每个体积重复3次,计算出平均峰面积。以质量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标得到标准曲线为y=2000000x-37973(R2=1)。

1.2.2.2 桑葚和树莓花色苷含量检测 将桑葚和树莓花色苷粗提物分别取定量用甲醇溶液(含有体积分数为0.1% HCl)溶解,取1 mL溶解液用0.45 μm滤膜过滤转移至棕色的液相小瓶内用于液相分析,液相条件同1.2.2.1,检测波长为280和520 nm,得到峰面积代入1.2.2.1标准曲线中进行定量计算。

1.2.3 中压快速分离系统分离桑葚及树莓花色苷条件的优化 分别取300 mg两种花色苷粗提物用2 mL分析纯甲醇超声溶解,经0.45 μm滤膜过滤备用,A相为一定浓度的甲酸水，B相为有机相，梯度洗脱条件为:0～2 min,20% B;2～22 min,20%～30% B;22～32 min,30%～40% B,检测波长280 nm,flash C18(80 g,20～35 μm,100 A)制备柱,两支串联,切峰收集到每根试管中,每根试管收集体积为10 mL。

根据以往研究数据[23],分别考察了有机酸浓度、有机相种类以及流速的大小对中压快速分离系统分离两种花色苷粗提物的影响。

1.2.3.1 有机酸浓度 研究表明在酸性条件下花色苷较为稳定,甲酸的加入可有效的减少拖尾的情况并能很好地改善分离效果[24],控制流速30 mL/min,B相甲醇,分别考察0.5%、2%和5%的不同甲酸浓度的水相体系。

1.2.3.2 有机相种类 控制流速30 mL/min,A相2%甲酸水,考察以甲醇和乙腈为有机相分别对中压快速分离系统分离两种花色苷粗提物的影响。

1.2.3.3 流速的选择 控制A相2%甲酸水,B相甲醇,考察20、30、40 mL/min 3种流速对中压快速分离系统分离两种花色苷粗提物的影响[10]。

1.2.4 HPLC-MS对其结构的鉴定 色谱条件:同1.2.2.1。

质谱条件:采用正离子模式;电喷雾电离离子源;扫描粒子范围:m/z 50～800;雾化器压力:45 psi;干燥器气流流速:12 L/min;干燥器温度:350 ℃[22]。

农业作为我国第一产业，主要是指利用植物的生长发育规律，通过人工培育来获得产品的产业，在我国国民经济建设中占据重要位置。农村经济合作组织，又可以称之为“农业合作社”，主要是指以家庭经营为主的农业小生产者联合组成的组织形式，力求维护和改善各自的生产及生活条件，具有服务性、盈利性、民主性以及双层次性等诸多特点，在农业发展中起到重要作用。基于此，本文就农业可持续发展对农村经济合作组织的要求进行阐述，并提出推进农业可持续发展的有效对策。

1.2.5 样品的纯度检测 纯度的计算公式为:

纯度(%)=峰面积带入标曲算出的质量浓度(mg/mL)/进样前目标化合物的质量浓度(mg/mL)×100

经中压快速分离系统纯化得到的桑葚的1峰和2峰及树莓的1峰和2峰四份冻干样品分别取定量用甲醇溶液(含有体积分数为0.1% HCl)溶解,取1 mL溶解液用0.45 μm滤膜过滤转移至棕色的液相小瓶内用于液相分析,得到峰面积代入1.2.2.1标准曲线中进行定量分析。液相条件同1.2.2.1。

图1 桑葚及树莓花色苷粗提物高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatograms of crude extracts of mulberry and raspberry anthocyanins 注:A、C:桑葚花色苷粗提物;B、D:树莓花色苷粗提物。

2 结果与分析

2.1 桑葚和树莓粗提物的花色苷含量检测

高效液相检测桑葚和树莓花色苷粗提物结果如图1所示,在520 nm检测波长下,图1C和图1D两种花色苷粗提物分别有两个主要的峰,在280 nm检测波长下,图1B树莓花色苷粗提物在两种花色苷主峰前有较多杂质峰,以矢车菊素-3-葡萄糖苷为标准品,计算桑葚中矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷的含量分别为22%、6%,树莓中矢车菊素-3-槐糖苷和矢车菊素-3-葡萄糖苷的含量为3.9%、4.1%。

2.2 中压快速分离系统最佳条件的确定

2.2.1 有机酸浓度的确定 如图2所示,当甲酸浓度为0.5%时,桑葚和树莓中压色谱峰拖尾明显,且分离效果也差于2%和5%的甲酸水相体系。洗脱液中甲酸浓度为2%和5%时中压分离图谱均不存在峰型拖尾现象,且分离效果相近,考虑到经济环保问题,最终确定2%的甲酸水为A相。

2.2.3 流速大小的选择 由图4可知,当流速为20 mL/min时,样品中目标组分在中压柱上保留性较强,洗脱峰宽且响应值偏低,每次进样只能得到少量的花色苷单体;而以40 mL/min洗脱时,目标峰易于洗脱,峰型集中且较尖锐,但经液相检测目标物与杂质未能有效分离,且流速越大,柱压越高,影响柱子寿命。当流速调整为30 mL/min时,三种花色苷单体与杂质的分离度能达到要求,且柱压在正常范围内。因此确定最佳流速为30 mL/min。

图2 不同甲酸浓度时桑葚和树莓花色苷粗体物中压快速分离系统色谱图Fig.2 Chromatogram of rapid separation of mulberry and raspberry anthocyanin in different formic acid concentrations

图3 不同有机相种类时桑葚和树莓花色苷粗体物中压快速分离系统色谱图Fig.3 Chromatogram of rapid separation of mulberry and raspberry anthocyanin in different organic phase species

图4 不同流速时桑葚和树莓花色苷粗体物中压快速分离系统色谱图Fig.4 Chromatogram of rapid separation of mulberry and raspberry anthocyanin in different flow rates at different flow rates

综上所述,中压快速分离系统分离两种花色苷的最佳条件为:A相2%甲酸水,B相甲醇,流速30 mL/min。

2.2.4 最佳洗脱条件的验证 在上述确定的最佳洗脱条件下获得的桑葚和树莓的中压快速分离系统的色谱图分别如图5中A、B所示,A图是桑葚花色苷粗提物中压图谱,由图5A可知,桑葚花色苷粗提物中在280 nm下组分单一,所以对应的中压图谱杂质峰较少,仅有两个主要的色谱峰,B图为树莓花色苷粗提物的中压分离图谱,由图5B可知,在280 nm下,树莓花色苷粗提物组分较复杂,对应在中压分离图谱上主要有4个峰,前两个峰的洗脱液经液相检测在520 nm并无吸收峰,因此上述接出的洗脱液为非花色苷物质可舍弃。分别收集上图所示的4个流出峰,4个峰所对应的洗脱时间分别为A118～21 min,A223～25 min;B121～25 min,B226～30 min,将所收集的4个峰洗脱液进行减压浓缩、冻干后进行下一步的纯度及结构鉴定。

图5 最优条件时桑葚和树莓花色苷粗提物中压快速分离系统色谱图Fig.5 Chromatogram of rapid separation system for crude extracts of mulberry and raspberry anthocyanins under optimal conditions

2.3 所得级分的HPLC分析及质谱结果鉴定

采用高效液相色谱分析中压快速分离系统所获得级分的色谱图如图6所示。图A为桑葚中压快速分离系统峰1的液相色谱图。在520 nm检测波长下,谱图中仅可见保留时间为22.5 min的色谱峰,无其它杂峰。经质谱分析,由图7A可知,桑葚中压快速分离系统峰1的分子离子峰为m/z 449,碎片离子峰为m/z为287,由分子离子峰m/z 449丢失一分子己糖所致,结合参考文献[25]可确定桑葚中压快速分离系统峰1的花色苷为矢车菊素-3-葡萄糖苷;经中压快速分离系统纯化后,以矢车菊素-3-葡萄糖苷为标准品,桑葚中的矢车菊素-3-葡萄糖苷含量由粗提物中的22%提升至95%,相比于桑葚级分峰1,所得桑葚级分峰2谱图中有少许杂峰,由图7B可知,桑葚级分峰2的分子离子峰为m/z 595,碎片离子峰m/z 287,由分子离子峰m/z 595丢失一分子鼠李糖所致,结合参考文献[25]可确定桑葚中压快速分离系统峰2的花色苷为矢车菊素-3-芸香糖苷;以矢车菊素-3-葡萄糖苷,桑葚中的矢车菊素-3-芸香糖苷含量由粗提物中的6%提升至41%。比较而言,树莓花色苷提取物经中压快速分离系统分离后所得两个级分色谱图均呈现单一、尖锐的峰,说明分离纯化效果较好,经质谱分析,由图7C可知,树莓中压快速分离系统峰1的分子离子峰为m/z 611,碎片离子峰为m/z 287,由分子离子峰m/z 611丢失一分子槐糖所致,结合参考文献[25]可确定图7C中的花色苷为矢车菊素-3-槐糖苷;由图7D可知,树莓中压快速分离系统峰2的分子离子峰为m/z 449,碎片离子峰为m/z 287,结合参考文献[25]可确定图7D中的花色苷为矢车菊素-3-葡萄糖苷,以矢车菊素-3-葡萄糖苷为标准品,树莓中的矢车菊素-3-槐糖苷含量由粗提物的3.7%增加到60%,矢车菊素-3-葡萄糖苷含量由粗提物的4.1%提升至75%。有文献表明,花色素B环的3碳位被双糖苷取代相较于被单糖苷取代的吸光度会大幅度下降,且在相同溶剂体系内,矢车菊素-3-单糖苷的吸光度可比矢车菊素-3-双糖苷的吸光度高3.8倍[26]。由此可知,桑葚和树莓花色苷粗提物经中压快速分离系统纯化后,矢车菊素-3-芸香糖苷和矢车菊素-3-槐糖苷的纯度理应较41%和60%更高。

图6 不同级分的HPLC分析图谱Fig.6 HPLC chromatograms of the fractions obtained from the medium pressure rapid separation system

图7 经中压快速分离系统纯化后的桑葚及树莓的1峰和2峰质谱图Fig.7 Mass spectrometry of 1 and 2 peaks of mulberry and raspberry purified by medium pressure rapid separation system 注:A:桑葚1峰;B:桑葚2峰;C:树莓1峰;D:树莓2峰。

2.4 与已有其他方法的对比分析

综上所述,将现有文献中花色苷的常用制备技术在上样量、制备时间、一次进样所获得单个花色苷量以及纯度等参数与本研究对比,结果见表1。高速逆流色谱每次可进样200 mg,单次洗脱就可得到15.0 mg纯度为95.5%的花色苷单体,但其耗时久,且需要多种挥发性有机溶剂,如乙醚、石油醚等;半制备高效液相色谱是目前分离纯化花色苷粗提物最常用的方法,虽然能在30.0 min的洗脱时间内能得到纯度为98.0%的花色苷单体,但每次进样量只有2.00 mg,单次处理量低且对流动相要求为色谱纯;葡聚糖凝胶柱层析虽然简单易操作,但上样量小,洗脱时间长,效率低,所获得的花色苷纯品量少且样品纯度低。

表1 本研究方法与已有方法对花色苷纯化效果的比较Table 1 Comparison of the current method and previous methods of purification of anthocyanins

相比较于以上几种分离纯化方法,中压快速分离系统具有上样量大、耗时短、经济、易操作等优点,其不仅分离效率高,在32.0 min的洗脱程序内,进样量可达300 mg,一次性可获得30.0 mg纯度为95.0%的矢车菊素-3-葡萄糖苷,可实现矢车菊素-3-葡萄糖苷标品的大批量制备。

3 结论

本文以桑葚和树莓为原料大量制备不同结构的花色苷,确定了中压快速分离系统分离两种花色苷粗提物的条件为流动相A为2%甲酸水溶液,流动相B为甲醇,最大进样量300 mg,流速为30 mL/min,梯度洗脱条件为:0～2 min,20% B;2～22 min,20%～30% B;22～32 min,30%～40% B。桑葚花色苷粗提物经中压快速分离系统纯化后的两种花色苷分别是矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷,其中矢车菊素-3-葡萄糖苷由粗提物中的22%提升至纯度为95%,矢车菊素-3-芸香糖苷由粗提物中的6%提升至41%;树莓纯化后的两种花色苷为矢车菊素-3-槐糖苷和矢车菊素-3-葡萄糖苷,分别由粗提物中的3.7%和4.1%提升至纯度分别为60%和75%。其中桑葚中的矢车菊素-3-葡萄糖苷的纯度达到了标准品要求,中压快速分离系统具有上样量大、分离速度快、分离效果好等优点,有望实现不同结构花色苷单体的快速分离与制备。