TNF-α促进上皮间质转化在肥胖相关性结肠炎-癌进展中的作用

许小凡，杨娟，来裕婷，周磊，石硌，王冲，张红，，段丽芳

1.陕西中医药大学医学科研实验中心，陕西 咸阳 712046；

2.宁夏医科大学临床医学院，宁夏 银川 750004；

3.陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳 712046

结肠癌是世界排名第三的消化道恶性肿瘤，每年导致约70 万人死亡[1]。近年来，结肠癌的发病率呈逐年上升趋势[1]。结肠癌的病理过程包括结肠黏膜细胞的基因突变、黏膜增生、腺瘤的形成及癌变的发生和转移等。研究发现，饮食习惯与结肠癌的发生存在一定的关系，尤其是高脂肪和低纤维素饮食与结肠癌的发病高度相关[2]。高脂饮食易引发肥胖，而肥胖时机体的慢性炎症状态被认为在肥胖与癌症的关系中发挥重要作用，可通过影响癌细胞的增殖、分化、凋亡最终导致癌变的发生[3]。

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)可发生于特定的生理或者病理状态，是指上皮细胞失去极性，向位于细胞基质的间质细胞转化的过程[4]。近年来的研究发现，在多种肿瘤的侵袭和转移过程中均可见EMT 的参与，已有的研究证实了细胞在发生EMT 后侵袭力及运动能力增强，这一特性使得癌细胞更易于转移和扩散，进而促进了肿瘤的发生发展[5-6]。

肥胖易导致结肠癌发生率增加，而EMT与肿瘤的发生和发展有着紧密联系，那么，EMT 是否与肥胖相关性结肠癌的炎-癌演变进程有关，目前尚不清楚。本研究拟通过高脂饲喂诱导小鼠肥胖，再采用促炎和基因毒性造模剂复制小鼠结肠炎-癌演进模型，通过观察其结肠组织病理改变、炎症因子及EMT标志物的表达改变，阐明EMT在肥胖相关性结肠癌的发生发展中的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 昆明种小鼠(雌) 30 只，6~8 周龄[(20±2)g]，购于西安交通大学医学院实验动物中心。

1.1.2 试剂与仪器 氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AMO)购自Sigma 公司，葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)购自MP Biomedicals公司，苏木精及伊红试剂购自索莱宝公司，TNF-α、E-cadherin、N-cadherin抗体及抗羊、抗兔SABC试剂盒均购自博奥森生物公司，显微镜及图像采集系统(日本奥林巴斯BX53)，其他试剂购于当地生物公司提供的最高纯度化学试剂。

1.2 方法

1.2.1 高脂饲料制作 小鼠高脂饲料中各成分比例为普通饲料70%、猪油10%、蛋黄10%、奶粉10%、胆固醇0.025%。

1.2.2 动物模型建立 昆明小鼠置于清洁级环境中饲养(20±2)℃，经7 d适应性喂养后先随机分为两组，即普通饲喂组组和高脂饲喂组，每组15 例。饲喂期间，普通饲喂组予普通小鼠颗粒饲料喂养，高脂饲喂组采用高脂饲料喂养。所有小鼠均自由饮食饮水，每天更换饲料和饮水，每周称量并记录体重，8周后挑选出高脂饲喂组中体重超过普通组小鼠体重的20%的小鼠，即为高脂肥胖小鼠(n=24)。随后将小鼠分为三组：①空白对照组(n=6)；②普通饲喂模型组(n=8)，以上两组继续普通饲料喂养；③高脂模型组(n=10)，继续给予高脂饲料喂养。将普通饲喂模型组及高脂模型组小鼠采用1 mg/mL AMO一次性腹腔注射(空白对照组小鼠予同等剂量生理盐水腹腔注射)，1周后开始予2.5%DSS代替饮水一周，正常饮水两周，依次循环至10周(空白对照组小鼠自由饮水)。

1.2.3 小鼠取材 在盲、结肠交界和骨盆处分离出全结肠，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗肠道，纵向剖开，观察结肠中形成的肿瘤个数及大小。留取小鼠的结肠组织，经4%甲醛溶液固定12 h 后以备后续组织脱水、包埋、切片用。

1.2.4 结肠组织的病理学观察 小鼠结肠组织常规脱水包埋后，制作3 μm石蜡切片。根据试剂盒说明采用苏木精—伊红染色法观察各组小鼠结肠组织的病理学改变。

1.2.5 免疫组织化学染色 小鼠结肠组织3 μm石蜡切片，脱蜡至水，枸橼酸缓冲液加热15 min，室温冷却后经PBS 洗5 min×3 次，3% H2O2室温孵育10 min，正常山羊血清封闭液室温孵育1 h；TNF-α一抗、E-cadherin 一抗、N-cadherin 一抗(均1∶200)4℃过夜，即用型生物素化羊抗兔二抗37℃孵育1 h；SABC 经37℃孵育30 min；DAB 显色、复染、镜验、脱水、封片，采用奥林巴斯显微镜BX53 观察并进行图像采集。每张切片在40 倍物镜下选取4 个视野计数阳性细胞的个数。

1.3 统计学方法 采用Graphpad Prism 5软件进行数据处理，计量资料符合正态分布，以均数±标准差表示，多组间计量数据比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用t检验，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠组织病理学改变 高脂模型组小鼠可见肠上皮细胞排列紊乱，杯状细胞消失，并可观察到类似上皮内瘤变的病理改变，而普饲模型组小鼠结肠黏膜层及黏膜下层大量炎性细胞浸润，但上皮内瘤变明显少于高脂模型组，见图1。

图1 各组小鼠结肠组织的病理学改变(HE染色，100×)

2.2 各组小鼠结肠组织TNF-α的表达变化 与空白对照组比较，普饲模型组和高脂模型组小鼠结肠组织中TNF-α阳染细胞均明显增加，且高脂模型组小鼠结肠TNF-α阳染细胞数较普饲模型组显著增加，差异均具有显著统计学意义(F=128.2，P<0.01)，见图2和表1。

表1 各组小鼠结肠组织TNF-α阳性染色细胞数比较(个/视野)

表1 各组小鼠结肠组织TNF-α阳性染色细胞数比较(个/视野)

注：与空白对照组比较，aP<0.01；与高脂模型组比较，bP<0.01。

组别空白对照组普饲模型组高脂模型组只数5 5 5 TNF-α阳性染色细胞数1.333±0.492 15.60±2.261a 25.82±6.353ab

图2 各组小鼠结肠组织TNF-α的表达变化(IHC，200×)

2.3 各组小鼠结肠组织E-Cadherin，N-Cadherin的表达变化 高脂模型组小鼠由于大量的肠上皮细胞破坏，结肠上皮标志物E-cadherin表达减少，间质标注物N-cadherin 表达明显增加，与空白组相比差异均具有显著统计学意义(P<0.01)；普饲模型组结肠上皮细胞E-cadherin 表达减少，N-cadherin 有所增加，但普饲模型组以上两种表达与高脂模型组比较差异具有显著统计学意义(P<0.01)，见图3和表2。

图3 各组小鼠结肠组织E-cadherin、N-cadherin的表达变化(IHC，200×)

表2 各组小鼠结肠组织E-cadherin、N-cadherin 的阳性染色细胞数比较(个/视野)

表2 各组小鼠结肠组织E-cadherin、N-cadherin 的阳性染色细胞数比较(个/视野)

注：与空白对照组比较，aP<0.01；与高脂模型组比较，bP<0.01。

组别只数空白对照组普饲模型组高脂模型组F值P值5 5 5 E-cadeherin阳性染色细胞数38.77±4.969 22.38±2.785a 9.583±2.392ab 207.5<0.01 N-cadeherin阳性染色细胞数2.667±0.866 5.273±1.794 16.36±3.641ab 90.28<0.01

3 讨论

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，近年来，结肠癌的发病率逐渐上升且趋于年轻化，尤其是45岁以下人群的结肠癌发病率也逐渐升高[7]。结肠癌的诱发因素众多，近来研究发现，高脂肪的摄入和低纤维饮食导致的肥胖与消化道肿瘤，尤其是结肠癌的关系较为密切，并且越来越多的研究一致认为肥胖可能是结肠癌的危险因素之一[8-9]。本研究分别在普通饲料喂养及高脂饲料喂养的小鼠中，以DSS 及AOM 诱导结肠癌模型，发现普通饲料模型组小鼠结肠组织腺体消失，可见大量炎症细胞浸润，而高脂饲喂组小鼠的肠上皮细胞亦失去原有的结构，杯状细胞消失，并且出现类似上皮内瘤变的病理改变，提示肥胖与结肠炎-癌进展关系密切，但其具体机制为何？

研究发现，肥胖人群血清中的炎性因子水平，如白细胞介素6、肿瘤坏死因子(TNF-α)等较正常人明显增高，认为脂肪的过度堆积易诱发机体的促炎氧化应激反应，使机体处于一种慢性低水平炎症状态，最终导致炎症因子的持续分泌[10]，其中TNF-α主要由肿瘤相关巨噬细胞分泌，在肿瘤炎症微环境中发挥启动慢性炎症的作用[11]。KUBOTA等[12]还发现持续低浓度的TNF-α可促进结肠癌的侵袭和转移。但其是如何促进结肠癌进展的呢？

近来研究发现，多种肿瘤的发生和发展与EMT有着非常紧密的联系[13-14]。EMT 是指具有极性的上皮细胞向存在于细胞基质的间质细胞转化的过程。由于间质细胞表现出细胞间连接较少的特性，且其与基底层的黏附力较上皮细胞弱，因此具有更强的运动力，这也是发生EMT 的细胞具有更强的侵袭力和运动力的重要原因[15]。发生EMT 的细胞E-cadherin、Ctokertin、Ocludin 等表达减少，N-cadherin、Vimentin、Fibronectin 等表达增加[13]。本研究发现，普饲模型组及高脂模型组小鼠的结肠组织中均出现大量的炎症细胞浸润，同时TNF-α表达也明显增加，而高脂肥胖组小鼠结肠组织中观察到类似上皮内瘤变的病理改变，且TNF-α阳染细胞数增加也更为明显，与普饲模型组差异有显著统计学意义(P<0.01)，提示肥胖时持续的慢性炎症可能参与了结肠癌的发生。通过进一步检测EMT的相关标志物，笔者发现高脂模型组小鼠结肠组织中上皮细胞的标志物E-cadherin表达显著减少，而间质细胞的标志物N-cadherin表达明显增加，与对照组及普饲模型组比较差异具有显著统计学意义(P<0.01)，进一步证实EMT 与肥胖相关结肠癌的发生密切相关。

综上所述，高脂诱导的肥胖与结肠癌的发生关系密切，其具体机制可能与肥胖引起的慢性炎症促进结肠上皮细胞发生EMT有关。