RhD多肽抑制抗原抗体结合的效果*

吴凡 庄乃保 梁爽 梁延连 苏宇清

RhD阴性血型作为一种特殊的稀有血型，在我国所占比例相对较少。近年来临床上RhD阴性血需求量呈逐年增加趋势，患者也常因术前无法找到合适匹配的血液而延误治疗。血型改造制备“通用血”是输血研究的一个重要课题。多肽药物的最新研究成果及高效价抗体可遮蔽Rh抗原的现象提示[1-5]，利用模拟多肽作为遮蔽物，可能会阻挡抗-D与红细胞表面RhD抗原结合位点，逃避免疫攻击（immune attack）达到血液通用的目的。本研究分析噬菌体表面展示技术筛选得到的RhD阳性噬菌体多肽的免疫遮蔽效果[6]，探讨利用具有生物活性的多肽遮蔽抗-D与RhD抗原的结合位点，使用生物信息学分析有效多肽理化性质及二级结构，以期提高临床输血的安全性。现报告如下。

材料与方法

1 实验试剂 IgG型单克隆抗-D，上海血液生物医药有限责任公司，批号：20171023；牛血清白蛋白（BSA），美国Amresco公司，批号：1652C18；荧光抗体FITC-标记山羊抗人IgG Fc（ab）2，美国Bio-rad公司，批号：STAR97PE；低离子盐溶液（LISS），美国Bio-rad公司，批号：05761.77.30；微柱凝胶低离子抗人球蛋白卡，美国Bio-rad公司，批号：50531.28.17；抗人球蛋白（抗IgG，C3d）检测试剂盒，上海血液生物医药有限责任公司，批号：20175002；其他试剂为国产分析纯。多肽，根据抗-D噬菌体克隆筛选推导出的4条较为有效12肽氨基酸序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成多肽[6]。多肽纯度为95%。

表1 RhD噬菌体多肽合成

2 实验仪器 SI500摇动式培养箱，英国Stuart Scientific公司； Labofuge 400R台式冷冻离心机，德国Heraeus公司；Centrifuge 5417R微型冷冻离心机，德国Eppendorf公司；FACSCantoTM流式细胞仪，美国BD公司。ID-Incubator 37 SI保温箱，瑞士Diamed AG公司；ID-Centrifuge 12 SII台式离心机，瑞士Diamed AG公司；FL Auto显微镜细胞成像仪，美国Life technologies公司。

3 方法

3.1 多肽理化性质及二级结构分析：根据分子量、纯度和质量用生理盐水溶解多肽，每条多肽分别配制成1 mg/50 μL、0.5 mg/50 μL、0.25 mg/50 μL、0.125 mg/50 μL共4个浓度。

有效多肽的分子质量（mass）、等电点（isoelectric point）、不稳定指数（instability index）、总平均疏水指数（grand averge of hydropathicity）使用在线工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protpatam/）进行分析。无规则卷曲（random coil）、抗原性（antigenic）使用在线工具EMBOSS（http：//emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss）进行分析。螺旋结构疏水面（hydrophobic face）、疏水力（hydrophobic moment）使用在线工具hbiQuest（http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParamsV2.py）进行分析。

3.2 多肽验证：20 mg/mL IgG型单克隆抗-D 50 μL/孔加于微孔板中（即每孔1 mg），分别与50 μL 3.1中溶解的不同浓度的多肽混合，37℃轻振孵育30 min。用LISS溶液制备5‰洗涤O型RhD阳性红细胞。加入5‰洗涤O型RhD阳性红细胞25μL/孔，阳性对照孔加入20 mg/mL IgG型单克隆抗-D 50 μL及5‰洗涤O型RhD阳性红细胞25 μL，阴性对照孔加入20 mg/mL IgG型单克隆抗-D 50 μL及5‰洗涤O型RhD阴性红细胞25 μL，37℃轻振孵育30 min。取50 μL反应物至微柱凝胶低离子抗人球蛋白卡中，1 000 g离心10 min。判定结果。

3.3 多肽遮蔽浓度检测：200 μg/mL的IgG型单克隆抗-D 50μL，分别与1 mg/50 μL、2 mg/50 μL的Peptide 4 50μL混合于已用0.5% BSA封闭的微孔板中，37℃孵育30 min。阳性对照孔加200 μg/mL的IgG型单克隆抗-D 50 μL与生理盐水50 μL混合，阴性对照孔加生理盐水100 μL。加入1%洗涤O型RhD阳性红细胞50μL/孔，37℃孵育1 h。生理盐水洗涤3次。最后一次洗涤后扣干，加入抗人球蛋白（抗IgG，C3d）100 μL/孔，1 000 g离心15 s，取10 μL/孔涂片，显微镜观察凝集情况。

3.4 多肽遮蔽效果检测：200 μg/mL的IgG型单克隆抗-D 50 μL，与2.5 mg/50 μL的Peptide 4 50 μL混合于用0.5% BSA封闭的微孔板中，37℃孵育30分钟。阳性对照孔加200 μg/mL的IgG型单克隆抗-D 50μL与生理盐水50 μL混合，阴性对照孔加生理盐水100 μL。加入1%洗涤O型RhD阳性红细胞20 μL/孔，37℃孵育1 h。生理盐水洗涤3次。加入10 μg/mL荧光抗体 FITC-标记山羊抗人IgG Fc （ab）2 100 μL/孔，37℃避光孵育30 min。生理盐水洗涤3次。最后一次洗涤后扣干，加生理盐水300μL/孔稀释。流式细胞仪检测平均荧光强度。

4 统计学处理 应用SPSS 20.0软件分析数据，计量数据用“均数±标准差（ ±s）”表示，P＜0.001表示有统计学差异。

结 果

1 多肽理化性质、二级结构及抗原性 生理盐水溶解后，Peptide 1呈弱混浊状，超声波助溶后溶解。Peptide 3呈强胶冻状。Peptide 2、Peptide 4溶于生理盐水。Peptide 1、Peptide 2、Peptide 3、Peptide 4的等电点值为6.71～10.00；亲水性由强至弱依次为Peptide 3＞Peptide 1＞Peptide 2＞Peptide 4；在不稳定性方面，Peptide 4最为稳定（32.42），而Peptide 3最不稳定（48.63）；无规则卷曲与抗原性均未在Peptide 1、Peptide 2、Peptide 3、Peptide 4中形成。

2 多肽验证 在微柱凝胶低离子抗人球蛋白卡中Peptide 3因呈强胶冻状不能通过微柱凝胶，未表现出明显阴阳反应。随着噬菌体多肽浓度增加，Peptide 1、Peptide 2、Peptide 4对IgG型单克隆抗-D与O型RhD阳性红细胞的凝集有一定剂量效应，其中Peptide 4剂量效应最为明显（图1）。

表2 有效多肽理化性质、二级结构及抗原性特征比较

3 多肽有效遮蔽浓度 当Peptide 4浓度为1 mg/50 μL时，其对IgG型单克隆抗-D和RhD阳性红细胞的凝集反应有一定的抑制效果，但仍有少量凝集；当Peptide 4浓度为2 mg/50 μL时，其抑制IgG型单克隆抗-D和RhD阳性红细胞凝集反应的效果较为明显，接近阴性对照（图2）。

4 多肽遮蔽效果 阴性对照与阳性对照的荧光强度分别为180.9±3.4、586.0±4.8（n＝8）。Peptide 4遮蔽后荧光强度为190.7±3.5（n＝3），与阳性对照相比，差异有统计学意义（P＜0.001）；与阴性对照相比，差异无统计学意义（P＝0.1373）（图3）。

讨 论

RhD抗原是除ABO血型抗原外最具免疫性的红细胞抗原。近年来，通过将生物化学与化学、材料科学、临床输血医学结合，使用化学材料修饰改造红细胞血型抗原的研究结果[7，8]，为制备无血型抗原的通用型红细胞，降低因血型不合所致的输血反应，提高输血的安全性，进行了富有创新性的探讨。用于RhD抗原化学修饰的大分子化学材料主要是聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）及其衍生物，但其有效性和安全性有待深入研究。

多肽因其功能明确、特异性高、副作用小、生产成本低等特性已广泛应用于生物医药和诊断试剂中[9-11]。其在高灵敏检测分析、诊断、蛋白质相互作用、抗感染新药研发及难治性病毒感染性疾病（如AIDS、HBV、HSV、Rabies virus等）与癌症治疗等方面显示出广阔的应用前景。多肽抗原易于制备、特异性强，具有更高的灵敏度和准确性，易于临床应用，可以弥补抗体在诊断领域中的不足，是理想的检测及治疗的材料。目前运用多肽抗原进行抗体检测的试剂有甲肝、乙肝、丙肝、庚肝等肝病病毒以及艾滋病病毒等[12-16]。本研究根据噬菌体表面展示技术筛选得到的阳性噬菌体氨基酸序列合成4条RhD噬菌体多肽[6]，从特异性、理化性质、二级结构、氨基酸序列等多方面进行深入研究。

多肽具有广泛的溶解性，但多肽红细胞凝集抑制实验的难点在于多肽的溶解。合适的多肽溶解方法是多肽实验成功的重要因素。不合适的溶解会造成多肽的损失和实验的失败，然而寻找理想的溶解方法有时具有相当的挑战性。多肽的溶解性很大程度上取决于多肽的极性，其溶解原理为：酸性的多肽溶解于碱性溶液，而碱性多肽可溶解于酸性溶液，含有大量不带电荷的极性氨基酸残基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有机溶剂中，如二甲

基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或异丙醇，然后加蒸馏水稀释。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解，因为DMSO可能造成侧链氧化。Peptide 1、Peptide2均为强碱性多肽（等电点值为10.00），Peptide 3、Peptide 4为酸性多肽（等电点值分别为6.71、6.74）。碱性多肽可先尝试用蒸馏水溶解；如果不溶于水，接着尝试用少量10%～25%醋酸溶解，如果仍然失败的话，可添加少量不饱和脂肪酸（Tallow Fatty Acid，TFA）（10～50）μL增溶，如果多肽一点都不溶，可用DMSO并以超声波助溶，最后用水稀释至理想浓度。酸性多肽也可先尝试用蒸馏水溶解；如果不溶于水，加入NH4OH（＜50 μL）助溶，并用去离子水稀释至1 mL。然而，红细胞膜渗透脆性大，凝集实验时需要充分考虑用于溶解多肽的溶剂是否会破坏红细胞，影响结果判读，而上述蒸馏水以及有机溶剂均不适用于红细胞相关实验。本研究采用生理盐水溶解多肽，但在阳性噬菌体状态表现出明显特异性的氨基酸序列[6]，在合成噬菌体多肽Peptide 3后却不溶于生理盐水，呈强胶冻状，严重影响多肽的验证试验。分析多肽不溶的主要原因是形成二级结构，而盐更会促进二级结构形成。

4条RhD噬菌体多肽总平均疏水指数均为负数，分别为-0.850、-0.683、-1.358、-0.050，表现出较强的亲水性。在抗原、抗体结合的过程中，多肽完整而稳定的空间立体构象是决定能否稳定结合的重要因素。Peptide 1、Peptide 4不稳定指数值分别为38.87、32.42，为稳定蛋白（不稳定指数＜40）。抗原性预测分析结果显示4条多肽均无抗原性，可避免经此多肽输入人体后产生针对该多肽的抗体，对本研究的目的而言是有利的（表2）。

微柱凝胶法检测血型的原理是：经过离心，未凝集的红细胞可通过凝胶的分子筛，到达凝胶底部，判断为阴性；而凝集的血块体积增大不能顺利通过凝胶的分子筛，根据凝块的大小所达到凝胶柱的位置不一样，从而可判断阳性的强弱。Peptide 3因呈强胶冻状而凝结于微柱凝胶低离子抗人球蛋白卡上层，红细胞被不能充分溶解的噬菌体多肽阻挡，不能通过微柱凝胶低离子抗人球蛋白卡的凝胶，影响了结果的判断。Peptide 1、Peptide 2随着浓度增加，IgG型单克隆抗-D与红细胞反应凝集程度减少，凝块有所减小，但遮蔽效果并不太理想。Peptide 4表现出抑制IgG型单克隆抗-D与RhD阳性红细胞发生凝集反应的剂量效应，但多肽浓度为1.0 mg/50 μL时仍未达到完全抑制（图1）。

显微镜观察可见，Peptide 4遮蔽浓度为1 mg/50 μL时，IgG型单克隆抗-D与RhD抗原的反应仍有少量凝集；当遮蔽浓度增加至2 mg/50 μL时，其抑制IgG型单克隆抗-D与RhD抗原的反应效果较为明显（图2）。流式细胞术检测结果显示，与阳性对照相比，2.5 mg/50 μL浓度的Peptide 4对IgG型单克隆抗-D与O型RhD阳性红细胞的凝集具有抑制作用（图3），达到了遮蔽效果。

本研究初步体现了RhD噬菌体多肽免疫遮蔽抗-D与RhD抗原反应的应用价值和潜在的应用前景，为今后RhD蛋白结构与功能研究及抗原性改造等做出一定的理论探索。然而，对于已产生大量抗-D抗体的个体，此多肽的遮蔽效果还有待提高，以减少个体输入量。多肽作为药物输入人体后，也可能会产生复杂的变化从而影响其稳定性和特异性，如何计算输入量达到理想的遮蔽效果等许多问题需进一步深入研究。