葡萄糖酸钙和氯化钙制备的血小板凝胶上清对脐带间充质干细胞作用的比较

刘素蕊 杨晓亚 高裕华 王更银

近年来，富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）的应用已不再局限于生理性止血、凝血及参与维持毛细血管的完整性等方面，它在运动医学及整形烧伤领域中所发挥的控制炎症，促进血管、组织愈合等作用也引起了广泛关注[1]。其发挥作用的关键在于PRP中的高浓度血小板被激活后释放活性颗粒，其中的生长因子可以促进创伤部位的修复。20世纪70年代，PRP首次分离并应用于临床手术患者[2]。PRP可由全血手工离心或血细胞分离机制备，其血小板浓度通常是全血中生理浓度的4～8倍[3，4]。PRP中加入激活剂，促使血小板激活形成凝胶（PRP gel）并释放胞内的多种生物活性分子，释放液称为PRP releasate，能够促进间充质干细胞的增殖、迁移等行为[5-8]，在细胞组织工程领域意义重大。但目前，制备PRP releasate的实验流程并不统一，使得对研究结果的解释缺乏比较意义。例如针对PRP的激活剂种类较多，包括凝血酶和/或葡萄糖酸钙及氯化钙等[9-11]。此外，激活所用的凝血酶多来源于牛或猪，还需考虑其在人体内的致敏性。有研究表明，在没有外源性凝血酶存在的情况下，PRP中含有的内源性凝血酶原在Ca存在的情况下，也可以活化形成凝血酶，最终形成PRP releasate[12]。所以，本实验在没有应用凝血酶的情况下以FBS培养细胞作为对照组，比较葡萄糖酸钙注射液和CaCl2注射液两种激活剂制备的PRP releasate对ucMSCs迁移和黏附等的影响，以期对PRP releasate和ucMSCs的联合应用提供理论依据。

材料与方法

1 材料 留取输血传染病检测为阴性的健康新生儿脐带，分离培养ucMSCs。

2 主要试剂 DMEM/F12培养基，Hyclone；胰蛋白酶，索莱宝；特级胎牛血清，BI；Transwell板，Corning；Matrigel，BD；Anti- Cdc42、Rac1、RhoA、integrinβ1，Abcam。

3 PRP releasate制备 PRP（含血小板1 000×109/L）中加入10%葡萄糖酸钙或5% CaCl2注射液（10∶1），室温作用40～60 min以凝固，离心留取上清，分别命名为葡萄糖-PRP releasate和CaCl2-PRP releasate。以FBS培养组作为对照。

4 细胞迁移实验 饥饿24 h的ucMSCs加入Transwell板（8-μm pore size，6.5 mm diameter）的上层小室，细胞数目为2×104。10% PRP releasate或FBS加入下层孔室。18 h后，棉签拭去上层胶，将迁移至底层的细胞固定，结晶紫染色，对三组细胞计数。

5 细胞黏附实验 以1∶300的浓度将Matrigel胶包被96孔培养板。风干12 h，PBS洗去多余的胶。将10%PRP releasate或FBS培养24 h的ucMSCs消化重悬后接种已包被的96孔板。分别在30 min、50 min两个时间点，用PBS将未贴壁的细胞洗去，甲醛固定15 min后吉姆萨染色，镜下计数三组的贴壁细胞。

6 Western blotting 以PRP releasate或10% FBS培养ucMSCs 48 h，PBS洗涤3次。提取细胞蛋白，检测Rho家族分子Cdc42、RhoA和Rac1的表达。

7 统计学处理 应用SPSS20.0软件，数据由 ±s表示，3组比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 细胞迁移能力 在下层小室加入两种PRP releasate和FBS作为趋化剂后，与对照FBS组相比，PRP releasate可促进细胞迁移（P＜0.05）。并且相较于CaCl2，葡萄糖-PRP releasate促迁移作用更显著（P＜0.05）。见图1。

2 细胞黏附 与对照组相比，两种PRP releasate促黏附能力更强，但葡萄糖酸钙和CaCl2两组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

3 Western blot 葡萄糖-PRP releasate促进Rho家族三个分子的表达（P＜0.05）；CaCl2-PRP releasate对Rac1和RhoA的影响次之（P＜0.05），但对Cdc42的表达影响与FBS组的差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

讨 论

PRP经激活后形成的PRP releasate可以释放多种因子，广泛应用于骨科、烧伤整形等学科[13]。因制备方法不同，前期获得的PRP中血小板数目及白细胞含量存在较大差别，并因此分为不同类型的成品[14-16]。结合我科兼具血站功能这一优势，本实验采用了机采血小板作为PRP releasate的制备来源，取材方便、可操作性强，避免了制备质量的波动性；此外，为降低不同献血员采集后PRP之间的差异，我们将9位同血型献血者随机分为3组，采集的PRP各留取2 mL混合用来制备PRP releasate。

为了更好地贴近PRP releasate临床应用，激活剂应该最大限度减少可能对人体产生的不利影响，以商品化的10%葡萄糖酸钙注射液和5%CaCl2注射液来制备PRP releasate较符合这一要求。就制备过程而言，10%葡萄糖酸钙促使PRP凝胶的形成较CaCl2快，约需30～40 min，5% CaCl2则需50～60 min。但前者析出上清的时间快，最终收集的上清体积稍少，剩余的固体凝胶体积较大。经过分子量和体积比的计算，相同体积的5% CaCl2中Ca含量还要稍高于10%葡萄糖酸钙。这也更加说明了实验结果的明显差异。有研究表明[12]，葡萄糖酸钙注射液比CaCl2注射液更加安全、便捷，我们的实验也得出相似的结论。究其原因，Ca2＋的适宜浓度及两种激活剂的化学成分对细胞是否有影响值得考虑。

ucMSCs近年来受到广泛的关注，是组织工程方面极具应用前景的一种细胞。它除了具有MSCs的所有特性[17-19]，还具有自身独特的优势：取材简易，与伦理道德的约束无冲突，更低的免疫原性、更快的克隆形成能力和更短的倍增时间[20，21]。因此，寻求ucMSCs与PRP releasate的最佳培养方式，替代传统细胞培养中的补充试剂FBS，使ucMSCs进一步发挥细胞治疗、组织修复的作用极具意义。实验结果显示，在对细胞迁移方面，葡萄糖酸钙-PRP releasate的效果更明显。然而，两种来源的PRP releasate对ucMSCs黏附的影响没有统计学意义，提示PRP releasate中复杂的因子成分及相关信号调控值得更进一步的研究。

细胞迁移和黏附是细胞发挥治疗作用的关键步骤。Cdc42、Rac1和RhoA是Rho GTPases家族中研究最多、最深入的三个分子，分别调节细胞板状伪足、丝状伪足和张力丝等肌动蛋白的聚合，与细胞迁移和黏附密不可分[22]。Western检测结果揭示了葡萄糖酸钙-PRP releasate明显促进Rho家族分子Cdc42、Rac1和RhoA的表达 （P＜0.05），提示ucMSCs迁移和黏附的能力增强与Rho家族三个分子的调控可能存在密切关系。我们的前期研究结果也显示，特定的细胞因子通过促进Rho家族分子Cdc42的表达，从而增强ucMSCs的增殖、迁移和黏附[23]。

综上，两种激活剂提取的PRP releasate所含因子浓度的差异，以及不同培养浓度上清对细胞的影响还值得进一步研究。两种PRP releasate对Cdc42、Rac1和RhoA三个分子的不同作用与对迁移和黏附的差异间的关系，也是我们下一步的实验内容之一。依据已有实验结果，相较CaCl2而言，葡萄糖酸钙激活的PRP releasate能够更好地促进ucMSCs迁移，从而为PRP与ucMSCs的联合移植应用提供了体外实验依据。