湿热证候动物模型研究述评

王瑶， 武曼丽， 郑锋玲， 刘珊， 骆欢欢

（1.广州中医药大学基础医学院，广东广州 501405；2.广东省中医院，广东广州 510120；3.广州中医药大学期刊中心，广东广州 510006）

湿热证候在中医临床上较常见，且涉及的疾病谱也较广泛，如感染性疾病、慢性代谢性疾病以及各系统疾病中均可出现湿热证的病理改变。临床研究表明，湿热证常包括多个子证型，主要有脾胃湿热、脾虚湿热、下焦湿热、肝胆湿热等；相关疾病分属多个系统，以消化系统、泌尿系统和内分泌系统疾病最为多见[1]。湿热证的临床表现以身热不扬、胸脘痞闷、身重体倦、大便黏滞不爽、舌红苔黄腻、脉象滑数为主症，以病情缠绵难愈为显著临床特征。中医病机学理论认为，湿热致病不离“湿热胶着”和“内外相引”。湿热胶着，湿与热易于合而为患，湿蕴热内，热处湿中，湿热相合，如油入面，胶结难分，难于速去，致使病情复杂、病程迁延。嗜食肥甘厚味、饮酒无度等可致湿热内生，若外界环境湿热氤氲，同气感召，则内外湿热相加为害致使病情反复发作，缠绵难愈。中医临床对湿热证的治疗颇感棘手，也严重影响了中医对疾病的整体治疗效果。

证候机理的研究是临床疗效提高的前提。深入阐释湿热证的证候本质，对于湿热致病条件下，如何做到既病防变，精准治疗，突破治疗瓶颈，进而提高病证整体疗效具有重要的意义。近年来随着对中医湿热证候研究的增多，中医湿热证动物模型构建方法也在不断创新，研究结果部分反映了湿热证候的特征及本质，然而其模型构建因素、成模标准、实际运用等均不能真正满足基础研究及临床中医现代化研究的需要。以下对近年来中医湿热证候的研究进展进行述评。

1 基于中医病机学说构建湿热证动物模型概况

1.1 温病湿热证动物模型清代医家柯韵伯所述“实则阳明，虚则太阴”，言简意赅地指出了外感温病湿热证的病机发展特点。基于此，有学者根据传统温病分类方法分别制备温病湿热证湿重于热、热重于湿的模型，将“中气实”“中气虚”与“内湿”“外湿”相互结合。

热重于湿模型的建立通常采用人工气候箱模拟外界湿热环境，通过高脂高糖饲料模拟体内湿热环境，采用灌胃附子干姜煎剂或大黄附子汤煎剂、灌胃鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌以造成脾虚等综合方式。结果显示此种热重于湿大鼠模型，其胃动素（MTL）和胃泌素（GAS）均较正常组降低，大鼠呈现体温升高，饮水量、饮食量、小便量减少，大便黏滞，喜打斗、毛色暗黄无光泽等现象；血清蛋白质组学差异表达研究显示，热重于湿大鼠血清中可见12 个具有差异性表达的蛋白质斑点[2-3]。

湿重于热模型采用人工气候箱模拟外界湿热环境、高脂高糖饲料模拟体内湿热环境、灌胃大黄煎剂或小承气汤、灌胃鼠伤寒沙门氏菌或不使用生物学因素等综合因素建立。结果显示此种湿重于热组小鼠血清D-木糖、血清淀粉酶低于正常对照组，大鼠大便稀薄程度和小便量增多程度显著高于热重于湿组和正常对照组，湿重于热组舌组织固有层炎症、充血及水肿较湿热并重组更显著[4-5]。

湿热并重模型采用人工气候箱模拟外界湿热环境、高脂高糖或高蛋白饲料模拟体内湿热环境、灌胃白酒模拟生活因素、灌胃鼠伤寒沙门氏菌或不使用生物学因素等综合因素建立。结果显示此种湿热并重大鼠的MTL 水平明显高于热重于湿组，GAS 稍微高于热重于湿组，小鼠存在肠道菌群结构失调，表现为大肠杆菌属、肠球菌属、梭菌属等条件致病菌过度增长[3，6]。

1.2 脏腑病机湿热证动物模型薛生白《湿热病篇》谓：“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热。”脾胃为后天之本、气血生化之源，脾喜燥而恶湿，同气感召，故湿热常易伤脾。有学者根据脾胃湿热证的病机以及临床表现，研究内外因结合造模法，即湿热环境加高脂高糖饮食加白酒或饮食失节的综合造模方法，结果显示此种脾胃湿热模型大鼠饮食减少、精神萎靡、毛发疏松粗糙，大便时干时溏，血清GAS 水平升高，肠组织中MTL 水平也升高，胃窦处有明显的溃疡和糜烂[7-8]。韦嵩等[9]采用人工气候箱、高脂高糖饮食、水杨酸钠灌胃等方法构建慢性胃炎脾胃湿热证模型，结果显示模型组大鼠饮食量、饮水量明显较正常组降低，体质量下降，水通道蛋白3（AQP3）、水通道蛋白4（AQP4）基因表达水平高于脾虚组。

中医认为，大肠为“传道之官，变化出焉”。大肠湿热证临证常见“腹痛下痢，里急后重”。有学者采用高糖高脂饲料、人工气候舱结合产毒性大肠杆菌灌胃造模，发现按此种方法建立的大肠湿热模型大鼠可出现肛温上升、肛门红肿出血、食欲不振等症状，几乎全部模型大鼠的肠管黏膜出现弥漫性充血、水肿，大量黏液和纤维蛋白渗出，病变主要见于十二指肠、空肠回肠、乙状结肠、直肠；电镜下可见肠组织细胞间隙扩大，细胞器肿胀，微绒毛稀疏变短[10-11]。也有学者采用以喂食肥甘及辛辣饲料、人工气候箱为基础，先后灌胃克林霉素磷酸酯及大肠杆菌的方法建立抗生素相关性大肠湿热证大鼠模型，结果显示模型组大鼠出现精神萎靡、喜扎堆、摄食减少、被毛稀疏无光泽、大便黏腻、排便次数增加等表现[12]。除出现以上外观表现外，模型大鼠还出现血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、二胺氧化酶（DAO）和D-乳酸含量升高，结肠组织过氧化物酶（MPO）含量升高，肠黏膜分泌性免疫球蛋白A（sIgA）含量降低，肠内容物中乳酸杆菌、双歧杆菌减少，而肠球菌、大肠杆菌显著增加等表现[12]。

有学者先用异硫氢酸苯酯灌胃诱导大鼠肝损伤，之后以人工气候舱、高脂高糖饮食构建肝胆湿热证胆汁淤积模型大鼠，结果显示黄疸湿热组模型大鼠体质量下降明显，肛温升高显著，血清胆红素、胆汁酸水平升高显著，并可见肝小叶欠完整，肝脏细胞肿胀变性，可见点状坏死等肝内胆汁淤积的病理特点[13-15]。也有学者[16]采用辛辣、油腻饲料喂养家兔构建胆囊炎湿热蕴结动物模型，结果发现模型组出现胆固醇结晶、胆囊黏膜粗糙等现象；光镜下可见黏膜的膜上皮萎缩、肌层增厚，并出现炎性细胞及渗出物。

2 湿热证候动物模型构建现状分析

2.1 构建机理1988 年，郭金龙等[17]率先提出基于中医学“外湿引动内湿”理论制备湿热动物模型，通过人工气候舱模拟长夏湿热环境造成外湿，饲喂大鼠“猪脂加蜂蜜”损伤脾气，使脾胃运化失常造成内湿；二者相互结合，制备湿热证候模型。1990年，王新华[18]在之前湿热证模型基础上联合大肠杆菌内毒素的生物学因素建立湿热证模型，其后吴仕九等[19]以湿热证的发病机理、临床表现以及西医传染病学为基础，研究了6种不同的造模方法，最后认为以饮食因素、气候环境因素、鼠伤寒沙门氏菌感染的综合因素造模方法比较理想。

湿热一证的致病机理始终不离饮食、环境、生物因素、疾病等，故其证候模型的构建始终重视以上相关因素[20]。饮食因素的构建常采用高脂、高糖饮食如“猪脂加蜂蜜”措施，或高蛋白饮食，此类方法均符合中医学理论，且能有效造成一定程度的代谢功能紊乱[17]。部分学者在造模中采取饮食失节的措施模拟脾胃损伤使脾失运化，也符合“太阴内伤”湿重于热的中医病机机理的。然而，大鼠、小鼠、兔等有着不同于灵长类的饮食结构需求，且该“脾失运化”未能有效通过客观指标证实。

对气候环境因素的构建方法，各位学者相对较为统一，多采用人工气候舱构建高温高湿环境，但温度、湿度没有统一的标准。值得一提的是，人工气候舱作为湿热证构建的重要工具，其性能稳定性堪忧，亟待环境温度湿度变动小、显示清晰、有一定通风功能的改良人工气候舱面世。

生物因素与疾病造模方法，其立意源于温病湿热证理论或疾病湿热证理论，从而形成了疾病证候模型，然而如何评价疾病对证候的影响，是值得研究探索的关键问题。另外，以多因素复合方式构建的湿热证候模型，因涉及施加因素太多，造成后期成模标准与因素分析的复杂化、不确定性。

2.2 模型动物本研究以“湿热，小鼠，模型”为关键词在中国知网上搜索，显示结果为91 条，在万方学位论文数据库上显示结果为25 条；以“湿热，大鼠，模型”为关键词在中国知网上搜索，显示结果为191条，在万方学位论文数据库上显示结果为147条；以“湿热，兔”为关键词搜索仅仅找到数篇相关文献。可见目前湿热证模型的造模动物多以大鼠、小鼠为主。

中医辨证诊断信息主要基于望、闻、问、切四诊。随着近年来中医现代化的进程，中医辨证诊断亦亟待客观化指标的补充与丰富，而证候动物模型的发展迟缓大大限制了中医证候客观化研究。其中的制约因素之一即是大鼠、小鼠、兔等证候模型的构建程度的不确定性，主要表现为上述动物模型症状、体征、舌象、脉象的不确定性，使证候模型时常呈现说服力不足的局面。

2.3 成模标准望、闻、问、切四诊是中医辨证的主要信息采集方法，因此虽然造模方法多种多样，但成模标准总离不开临床表现。湿热证候模型多以观察动物的体质量、背毛、活动、饮食及饮水量、粪便等为主，而仅以此来判断造模成功与否是缺乏严谨性的；且以上变量指征的可控性和可重复性较差，也未能反映中医诊断学中舌诊、脉诊的内容。如在小鼠实验中发现，小鼠自身体温变动极大，不宜用于模拟温病湿热证的体温改变。

随着中医药的现代化发展，湿热证候的生物学基础也得到了广泛而深入的研究，免疫炎症、氧化应激、脂质代谢、水通道蛋白等相关通路与湿热证候模型均呈现显著关联，部分指标甚至具有相对特异性，如脂多糖（LPS）、Toll 样受体4（TLR4）、核因子κBp65（NF-κBp65）、水通道蛋白3（AQP3）等[21-24]。近年来，宏基因组学、基因组学、代谢组学、蛋白组学等技术快速发展，通过测序后发现中医证候的特异性生物标志物的研究也受到了广泛关注，湿热证候模型成模标准的研究也出现了新的方向。有学者对湿热证候模型小鼠的组学进行研究，结果显示模型小鼠肠道菌群、血清蛋白质组学出现了一些规律性的改变[25-26]。

3 湿热证候模型构建方法的改良思路

3.1 构建机理的改良在既往众多研究者对湿热证候模型的探索、归纳、总结的基础上，有研究者尝试以高糖饮食、高脂饮食、高蛋白饮食，及湿热环境等因素分别造模，结果发现单纯的湿热环境、单纯的高脂饮食均能使小鼠呈现体质量增长缓慢、背毛潮湿、阴囊下坠、大便黏滞等表现，并同时存在LPS、TLR4、AQP3 及舌、结肠HE 染色病理、肠道菌群的改变[25-26]，可部分解决复合因素造模可重复性差、不确定性大的弊端。

3.2 模型动物的选择为尽量模拟展示湿热证候模型的四诊资料如舌象、脉象等，可选择一些比较接近人类的生理特性的动物，非人灵长类动物是目前较为合适的选择。非人灵长类与人类基因组序列具有高度的同源性，在生理结构、代谢周期、行为方式等方面与人类有高度相似性。如猕猴也有ABO 血型，雌性猕猴性周期为21 ～28 d，月经周期2 ～3 d，这些都与人类高度相似。作为世界范围内分布最广的非人灵长类，猕猴属（Macaca）物种是科学研究的重要模型动物，特别是在生物医学模型的研究中发挥了重要作用[27-28]。目前猕猴在生物医学中的应用主要用于传染病研究、疫苗实验、药理毒理学研究、器官移植研究等方面，猕猴的生理与病理特性与人类高度相关。故认为可采用猕猴作为湿热证候模型动物，并进行中药干预。目前广东、云南、海南、广西等地均有成熟猕猴实验基地，利用这些地区的天然湿热气候构建湿热证候模型是可行的。

除此之外，近年来肠道微生态、基因测序等在湿热证候研究中受到了极大的重视，无菌动物、基因敲除动物也是探索湿热证候病证结合的理想模型动物。

3.3 成模标准的确立目前评价湿热证候模型缺乏统一的成模标准，这不仅仅阻碍了湿热证候模型的发展，也为后续湿热证候相关疾病的研究及药物研发增加了阻力，是湿热证候研究亟待解决的核心技术问题。“整体观念”和“辨证论治”为中医学的两大基本特点，湿热证候及其他中医证候模型的研究均不能将此二者忽视。成模标准应兼具针对性及客观性，需要形成一套既符合中医学辨证理论，又可以稳定地在动物模型上体现的指标体系，故若能涵盖表观学、舌象图片分析、舌组织HE染色病理、血液指标检测、蛋白组学等的指标体系可能更有优势。湿热证候由多因素致病，湿热证候模型成模标准应有多个指标，这些指标间是相互关联的，若只是用其中一个指标来评价模型成功与否，与中医学“整体观念”显然是相悖的。各指标之间应有一个主次的权重关系，以此判断造模成功与否。

中医证候研究应始终基于临床。深化湿热证候生物学基础研究亦需基于临床实际，细化成模标准，并参照湿热证候理论进行反向验证，不断改进。中医证候模型的发展是中医药现代化一个至关重要的环节，如何制作能更有效模拟的科学的中医证候模型将是今后证候模型研究的方向。