响应面法优化芒果果醋发酵工艺研究

邓春丽，韦芳兰，苏辉兰，陈振林，段振华*

(1.贺州学院 食品科学与工程技术研究院，广西 贺州 542899； 2.贺州学院 食品与生物工程学院，广西 贺州 542899)

芒果(MangiferaindicaLinn.)是漆树科杧果属常绿大乔木，原产于印度，在我国海南、广西、广东、云南、福建和台湾等地有广泛种植，广西芒果种植面积占全国种植面积的1/4以上[1，2]。芒果果实营养丰富，含糖量在7%以上，磷、钙、铁等矿物质含量较高，维生素A、B、C含量均高于普通水果，其中维生素A的前体胡萝卜素含量丰富[3]。芒果中没食子酸、香豆素、芒果苷、香草醛、单宁等多酚物质含量丰富，具有抗氧化、抗癌、防治心脑血管疾病、去痰止咳等功效[4，5]。目前芒果深加工产品较少，主要有芒果罐头、芒果汁、芒果果酱、芒果果脯等[6]。

近年来，随着人们生活水平的提高，苹果醋、山楂醋、桑果醋等各种果醋饮品不断投入研发并投放市场，受到越来越多消费者的青睐。芒果经发酵处理制成果醋，既能解决芒果采后易腐烂、难贮藏的问题，又能丰富果醋市场。本研究在优化酒精发酵工艺的基础上，利用响应面法优化芒果果醋的醋酸发酵工艺条件，为芒果果醋的开发与工业化生产研究提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芒果：贺州本地市售的青皮芒；蔗糖：市售；氢氧化钠、无水乙醇等：均为分析纯；葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、琼脂等：均为生化试剂；果胶酶(10000 U/mL)：诺维信生物技术有限公司；果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌(菌号AS1.41)：广东省微生物菌种保藏中心。

1.2 仪器与试剂

JD-322 榨汁机 金达电器公司；ZWYR-D2403恒温振荡摇床 上海智诚分析仪器制造有限公司；YP1201N电子天平 上海仪器总厂；HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；LH-B55数显折光仪 杭州陆恒生物科技有限公司；FE20精密pH计 梅特勒-托利多集团；SQ510C高压蒸汽灭菌锅 重庆雅马拓科技有限公司；DL-CJ-2N超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；DA-130酒精计 日本京都电子公司；UVl901PC紫外可见分光光度计 上海奥析科学仪器有限公司；PAL-1糖度计 日本 ATAGO(爱拓)科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

试验时选择完好无损的芒果用流动水冲洗干净后去皮、去核置于打浆机中，加入0.01%维生素C(按果重计)，破碎压榨，加入0.01%果胶酶(以原果果汁计)40 ℃保温2 h进行酶解，获得芒果汁，备用。

菌种活化：分别参考王乃馨等[7]和李英等[8]的方法对果酒酵母和醋酸菌进行活化。

1.4 试验内容

1.4.1 酒精发酵条件优化

将活化后的酵母种子液接入到经果胶酶处理后的芒果汁中，进行酒精发酵，根据预试验结果，筛选料液比(芒果果汁∶蒸馏水，V/V)、初始糖度、酵母接种量、发酵温度为影响因素，酒精度为指标，采用正交试验方法，优化芒果酒精发酵工艺条件。

1.4.2 醋酸发酵条件优化

将活化后的醋酸菌种子液接入到初始酒精度为6%的芒果果酒中进行醋酸发酵。分别以接种量、装料量、发酵温度、发酵时间为影响因素，以醋酸产量(酸度)为响应值，采用四因素三水平的响应面试验优化醋酸发酵工艺条件，试验因素和水平设计见表1。

表1 响应面试验水平设计Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.5 测定方法

使用酒精计、糖度计、pH计分别测定酒精度、糖度、pH值；酸碱中和滴定法测定酸度。

2 结果与分析

2.1 芒果酒精发酵工艺优化

综合预试验及单因素试验结果，以料液比 (1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3)、初始糖度(14%、16%、18%、20%)、酵母接种量(0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)、发酵温度(28，30，32，34 ℃)为影响因素，以酒精度为考察指标，进行正交试验，正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests

续 表

由表2可知，发酵温度及料液比对芒果酒精发酵有较大影响，各因素对芒果酒精发酵阶段的酒精度影响大小顺序依次为：发酵温度>料液比>初始糖度>酵母接种量。芒果酒精发酵条件优化组合为A2B3C2D4,即料液比为1∶2(V/V)，初始糖度为18%，酵母接种量为0.2%，发酵温度为34 ℃。在优化组合条件下进行验证试验，结果表明芒果酒精发酵酒精度为6.62%。对此条件下发酵3 d所得的芒果果酒进行过滤及成分调整后，接种醋酸菌进行醋酸发酵。

2.2 芒果醋酸发酵工艺单因素试验

在前期试验基础上，将芒果酒精发酵后的发酵液酒精度调整为6.0%，摇床转速为120 r/min，考察醋酸菌接种量(%)、发酵温度(℃)、装料量(%)及发酵时间(d)4个影响因素对醋酸发酵的影响。

2.2.1 接种量对芒果醋发酵的影响

固定发酵条件为温度30 ℃，装液量60%，发酵时间5 d，考察不同醋酸菌接种量(4%、6%、8%、10%、12%)对醋酸发酵的影响，试验结果见图1。

图1 接种量对醋酸发酵的影响Fig.1 Effects of inoculum size on acetic fementation

由图1可知，发酵液酸度随着接种量增加呈先增后减的趋势，接种量为8%时达到峰值。在一定的发酵液中营养物质相对固定，当接种量过低时，发酵液中的菌体较少，发酵不彻底，导致醋酸产量较低；接种量过大，需要更多的营养物质用于菌体自身的生长繁殖，从而导致用于生成醋酸的底物较少，影响醋酸产量[9，10]。

2.2.2 发酵温度对芒果醋酸发酵的影响

固定醋酸菌接种量为8%，装液量为60%，发酵时间为5 d，考察不同发酵温度(26，28，30，32 ℃)对醋酸发酵的影响，试验结果见图2。

图2 发酵温度对醋酸发酵的影响Fig.2 Effects of fermentation temperature on acetic fermentation

由图2可知，发酵液酸度随着发酵温度逐渐升高呈先增后减的趋势，32 ℃时达到峰值。出现这种现象的原因是在一定空间里，温度过高会加速菌体的生长，使得菌体提前老化，导致发酵液酸度降低[11,12]。

2.2.3 装料量对芒果醋酸发酵的影响

醋酸菌专性好氧，其生长需要足够的氧气，氧气充足的条件下，菌体生长繁殖旺盛，氧气不足则会抑制发酵的进行[13]。不同的装料量对发酵液的供氧量不同。固定发酵条件为醋酸菌接种量8%、发酵温度32 ℃，连续发酵9 d，考察不同装料量(20%、30%、40%、50%、60%)对醋酸发酵的影响，试验结果见图3。

图3 装料量对醋酸发酵的影响Fig.3 Effects of loading volume on acetic fermentation

由图3可知，发酵初期发酵液中醋酸含量增加较快，且装料量越低，产酸能力越强,当发酵时间为7 d时，不同装料量的发酵液中酸度均达到最大值；在7 d以后醋酸产量开始降低，可能是由于菌体生长繁殖消耗过多的营养物质及发酵后期菌体老化等[14]。

2.2.4 发酵时间对芒果醋酸发酵的影响

固定发酵条件为醋酸菌接种量8%、发酵温度32 ℃，装料量30%，考察不同发酵时间(3，4，5，6，7，8，9 d)对醋酸发酵的影响，试验结果见图4。

图4 发酵时间对醋酸发酵的影响Fig.4 Effects of fermentation time on acetic fermentation

由图4可知，发酵初期发酵液酸度增加较快，发酵7 d时，发酵液的酸度达到峰值，继续发酵，则发酵液中的酸度有下降的现象。原因可能是发酵前期发酵液中营养物质充足，使菌体大量繁殖，代谢产物速度快；7 d后进入发酵后期，发酵液中的营养物质已被过多消耗且菌体开始老化导致醋酸产量稍有降低或趋于平稳。

2.3 芒果醋酸发酵工艺响应面试验优化

根据单因素试验结果，以酸度(Y)为评价指标，选取醋酸菌接种量(6%、8%、10%)、发酵温度(30，32，34 ℃)、装料量(20%、30%、40%)和发酵时间(6，7，8 d) 4个因素，应用Box-Benhnken对芒果醋酸发酵工艺进行响应面分析试验，试验设计及结果见表3，回归模型方差分析结果见表4。

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Design and results of response surface tests

表4 响应面二次回归方程模型方差分析结果Table 4 Variance analysis results of response surface quadratic regression equation model

注：“*”表示差异显著(P<0.05)，“**”表示差异极显著(P<0.01)。

利用Design Expert 8.0.6软件对表3进行回归分析，得到醋酸产量(酸度Y)对自变量接种量(A)、发酵温度(B)、装料量(C)和发酵时间(D)的二次多项回归方程为：

Y=4.109-0.15A+0.174B-0.027C+0.011D-0.095AB-0.061AC+0.112AD-0.122BC-0.87BD+0.007CD-0.485A2-0.48B2-0.494C2-0.537D2。

由表4可知，该模型的P<0.0001，回归模型极显著，失拟项不显著(P=0.0704>0.05)，说明所得模型拟合性较好。相关系数R2=0.9312,调整系数RAdj2=0.8623，信噪比(11.22)远大于4，说明预测值与试验值有较好的相关性，试验误差较小。因此可用此模型对芒果果醋的发酵工艺条件结果进行分析和预测。

模型方程的一次项A、B的P值均小于0.05，说明接种量、发酵温度对结果影响显著，且一次项各因素对醋酸产量影响的大小顺序为：发酵温度(B)>接种量(A)>装料量(C)>发酵时间(D)。二次项A2、B2、C2、D2的P值均小于 0.01，具有极高的显著性，说明醋酸产量的变化相对复杂，各因素对醋酸产量的影响不是简单的线性关系，响应面效应显著，相应的响应面见图5。

图5 接种量、发酵温度、装料量和发酵时间的交互 作用对芒果醋酸发酵影响的响应面Fig.5 Response surface figures of the interaction of inoculum size, fermentation temperature, loading volume and fermentation time on mango acetic acid fermentation

由图5可知，该结果与单因素试验结果一致，随着因素水平的增大，酸度呈先增大后逐渐减小的趋势。利用Design Expert 8.0.6软件优化分析，得到芒果醋酸发酵的最佳工艺条件为接种量7.74%，发酵温度32.4 ℃，装料量29.56%，发酵时间6.98 d，根据模型预测得到的理论最大酸度为4.04 g/dL。

2.4 验证试验

为了验证模型的可靠性和实用性，将工艺条件调整为：接种量7.7%，发酵温度32.5 ℃，装料量30%，发酵时间7 d，在此条件下测得芒果果醋的酸度为3.99 g/dL，与最优条件下的理论值(4.04 g/dL)接近，说明经响应面法优化的芒果果醋发酵工艺是可行的，具有实际应用价值。

2.5 芒果果醋质量评价

在优化条件下发酵得到的芒果果醋按照GB 18187—2000《酿造食醋》、GB 2719—2003《食醋卫生标准》的要求进行理化、卫生指标检测，结果如下：总酸(以乙酸计)含量为3.99g/dL；可溶性无盐固形物含量为1.86g/dL,菌落总数为2CFU/mL；大肠菌群为0MPN/dL，致病菌(金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌)、游离矿物、总砷(以As计)、铅(Pb)、黄曲霉毒素B1均未检出；且芒果果醋澄清，具有醋味柔和、芒果典型香气和色泽的特点。果醋的理化、卫生指标均符合国家标准。

3 结论与讨论

正交试验结果表明各考察因素对酒精度影响大小顺序依次为：发酵温度>料液比>初始糖度>酵母接种量。芒果酒精发酵条件优化组合为A2B3C2D4，即料液比为1∶2(V/V)，初始糖度为18%，酵母接种量为0.2%，发酵温度为34 ℃；此条件下发酵所得芒果果酒的酒精度为6.62%。

通过响应面试验优化出的芒果醋酸发酵最佳工艺条件为：接种量7.7%，发酵温度32.5 ℃，装料量30%，发酵时间7 d，在此条件下发酵所得芒果果醋的酸度为3.99 g/dL。经质量评价得出该芒果果醋质量符合GB 18187—2000《酿造食醋》、GB 2719—2003《食醋卫生标准》的要求，且果醋澄清，具有醋味柔和、芒果典型香气和色泽的特点。在本试验范围内建立的模型准确有效，可用来预测设定条件范围及其周围的芒果果醋发酵工艺参数，对发酵芒果果醋的后续研究及工业化生产具有较好的参考价值。