响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌发酵水豆豉的工艺条件

李杨，陈宇航,，刘雪薇，裴晓方*

(1.四川大学 华西公共卫生学院/华西第四医院，成都 610041； 2.食品安全监测与风险评估四川省重点实验室，成都 610041； 3.上海市疾病预防控制中心，上海 200336)

水豆豉作为传统黄豆发酵食品，深受西南地区人民喜爱。微生物在发酵过程中产生酶而使黄豆中的原料发生水解，形成了水豆豉特有的风味。水豆豉富含蛋白质、维生素、矿物质等营养物质，并有潜在的预防胃损伤和抗氧化等功能[1]。发酵过程中有大量诸如豆豉纤溶酶、抗氧化剂等代谢产物产生[2]，丰富食品的营养价值。但是，我国水豆豉的生产仍以自然发酵为主。在自然发酵过程中，不同生产来源的水豆豉容易受发酵温度、时间、微生物这些环境因素的影响，无法保障水豆豉的营养价值及食用安全。本课题组前期从水豆豉中分离得到一株高产豆豉纤溶酶的贝莱斯芽孢杆菌，若能将其接种黄豆进行发酵条件的优化，将会大大提高水豆豉的发酵品质。

水豆豉的发酵步骤可分为：浸泡、沥水、蒸煮、冷却、前发酵、加辅料及后发酵阶段。由于后发酵阶段涉及佐料的加入以及发酵时间过长，本研究主要优化前发酵阶段的环境参数。发酵过程中影响水豆豉品质的环境参数有很多，最常纳入优化的发酵条件有发酵温度、发酵时间和菌株接种量[3-5]。本研究首先通过单因素法控制发酵温度、发酵时间和菌株接种量，缩小发酵条件范围，再根据响应面法优化得出水豆豉的最优发酵条件，比较发酵优化水豆豉与市售水豆豉之间的差异，为贝莱斯芽孢杆菌发酵水豆豉提供了科学理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

一等黄豆：成都人民营养食品厂；贝莱斯芽孢杆菌：本课题组分离纯化；LB肉汤：北京路桥技术有限责任公司；市售水豆豉：贵州某品牌；纤维蛋白原F3879-250 mg、凝血酶T4648-1 kU：Sigma公司；尿激酶 U108373-10 mg：Aladdin公司；琼脂糖：TQINGKE公司；盐酸：北京化工厂；无水碳酸钠：天津博迪化工股份有限公司；磷酸氢二钠、四硼酸钠：天津市瑞金特化学品有限公司；酚酞、乙醇、甲醛：成都市科龙化工试剂厂；氢氧化钠：天津致远化学试剂有限公司。

1.2 设备与仪器

PICO21、FRESCO21离心机 Thermo公司；SQP千分之一、万分之一电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；隔水式恒温培养箱 上海飞越实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 水豆豉发酵步骤

称取30 g黄豆，加入3倍浸泡水量的超纯水，浸泡12 h。沥干后高压蒸汽灭菌30 min，待自然冷却接入菌液摇匀，恒温培养，1～5 d后收获水豆豉。同时设置阴性对照，即黄豆经高压灭菌后不接种菌液，其余发酵步骤相同。

1.3.2 水豆豉发酵检测指标

针对水豆豉发酵优化方向，检测指标包括感官指标和理化指标。

1.3.2.1 感官指标[6]

感官指标分为形态、粘液、拉丝、气味、口感5个部分，由实验人员组成评价小组，独立判断后打分，取平均值作为最终结果。

表1 水豆豉感官评分表Table 1 Sensory evaluation standard of fermented soya beans

注：拉丝长度测定标准是将水豆豉搅拌2 min后，用枪头挑起，以10 cm为1个单位从中间挑起，垂直拉10 cm为2个单位，再从拉起的10 cm中挑起，重复进行，直到拉丝断裂，记录拉丝单位。

1.3.2.2 理化指标

理化指标包括氨基酸态氮、总酸、还原糖、pH值和豆豉纤溶酶活性，参照国标GB 5009.235-2016《食品中氨基酸态氮的测定》、GB 5009.7-2016《食品中还原糖的测定》、GB 5009.237-2016《食品中pH值的测定》的方法[7-9]，采用化学法测定水豆豉中的氨基酸态氮、总酸和还原糖含量，采用pH计检测水豆豉中的pH值，采用纤维蛋白平板法检测水豆豉中的豆豉纤溶酶活性[10]。

1.3.3 单因素法发酵试验

选取不同发酵时间(1，2，3，4，5 d)、不同发酵温度(25，30，35，40，45 ℃)和不同接菌量(0.01%、0.1%、1%、5%、10%)3个因素做单因素法发酵试验，以水豆豉发酵检测指标作为评价标准来缩小最佳发酵条件范围。

1.3.4 响应面法发酵试验

在单因素发酵试验的基础上，经Design Expert 8.0.6软件，以水豆豉中氨基酸态氮含量(Y1)和豆豉纤溶酶活性(Y2)为响应指标，以Box-Behnken模型按照三因素三水平设计获得17种发酵条件，包括13个析因实验和4个检验误差的零点试验。按1.3.1发酵步骤进行试验，确定最优发酵条件。

1.3.5 最优发酵条件水豆豉品质检测

参照1.3.2.2的方法，将最优发酵条件的水豆豉与市售的水豆豉进行比较，以未加菌发酵的黄豆作为阴性对照，检测理化指标包括氨基酸态氮、总酸、pH值、还原糖含量和豆豉纤溶酶活性。

2 结果与分析

2.1 单因素法发酵试验

2.1.1 发酵时间对水豆豉发酵检测指标的影响

不同发酵时间下，水豆豉发酵检测指标变化见图1。

由图1可知，氨基酸态氮含量随着发酵时间的增加而增加。总酸含量在0～2 d增加，在3～5 d下降。还原糖含量在0～3 d基本保持稳定，3～4 d上升，4～5 d下降。pH值在发酵5 d内变化较小，酸碱度从弱酸性变为中性。豆豉纤溶酶活性在0～4 d内都呈现上升趋势，在3 d达到最大，之后随着时间延长，酶活性略有下降。感官评价差异较小，在41～63分范围内。因为氨基酸态氮含量、还原糖含量、豆豉纤溶酶活性为越高越好，总酸含量为越低越好，综合考虑，将发酵时间限定在3～5 d。

图1 不同发酵时间对水豆豉发酵检测指标的影响Fig.1 Effect of fermentation time on the detection indicators of fermented soya beans

2.1.2 发酵温度对水豆豉发酵检测指标的影响

不同发酵温度下，水豆豉发酵检测指标变化见图2。

由图2可知，氨基酸态氮含量在25～40 ℃范围内逐渐上升，在40～45 ℃范围内开始下降。总酸含量波动较大，25～35 ℃范围内总酸含量高于30～45 ℃。还原糖含量也呈现波动状态，先增加后降低再上升。pH值在发酵5 d内变化较小。豆豉纤溶酶在25～40 ℃范围内，活性先降低后升高，45 ℃时未检测到酶活性。感官评价指标变化较小，在40～65分范围内。综合考虑，将发酵温度范围限定在35～40 ℃。

图2 不同发酵温度对水豆豉发酵检测指标的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on the detection indicators of fermented soya beans

2.1.3 接菌量变化对水豆豉发酵检测指标的影响

不同接菌量下，水豆豉发酵检测指标变化见图3。

图3 不同接菌量对水豆豉发酵检测指标的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on the detection indicators of fermented soya beans

由图3可知，接菌量对氨基酸态氮含量、总酸含量、还原糖含量及pH值的影响均较小。豆豉纤溶酶活性变化较大，0.01%～1%范围内活性下降明显，1%～10%范围内保持稳定。感官评价指标的变化依旧不明显，在42～45分范围内。考虑不同接菌量下氨基酸态氮、还原糖、总酸、pH值变化较小，以豆豉纤溶酶活性变化为主，将接菌量限定在0.01%～0.1%范围内。

2.2 响应面法发酵试验

单因素发酵试验缩小的最佳发酵条件范围为发酵时间3～5 d，发酵温度35～40 ℃，接菌量0.01%～0.1%。根据该条件设计的试验因素水平见表2，试验设计和检测结果见表3。

表2 试验因素编码及水平表Table 2 The factors and levels of experiment

表3 响应面试验设计及指标Table 3 Response surface design and responses

2.2.1 回归模型建立及方差分析

应用Design Expert 8.0.6软件对表3中的数据进行回归分析，得到回归方程预测模型：

Y1=5.83×10-5-2.47×10-5×A+1.94×10-3×B-5.91×10-6×C。

Y2=2594.70-55.88A-415.30B+7970.77C-10.73AB-182.17AC-1467.06BC+0.96A2+107.93B2+36394.11C2。

方差分析验证模型及各参数的显著性见表4和表5。

表4 氨基酸态氮回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model of amino acid nitrogen

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。

表5 豆豉纤溶酶回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model of fibrinolytic enzyme

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。

两者模型的P<0.05，表示可用该模型分析。失拟项的P>0.05，表示拟合较好，可用其替代真实点进行分析。由表4和表5可知，氨基酸态氮的响应值与温度、接种量关系较小，与时间关系较大。而豆豉纤溶酶的响应值与温度、时间、接种量、时间×接种量、时间×时间、接种量×接种量显著相关，由F值可以看出，以豆豉纤溶酶酶活为响应值影响水豆豉发酵的因素从大到小依次为：发酵温度>发酵时间>接种量。

2.2.2 响应面分析

水豆豉各发酵条件对豆豉纤溶酶活性的影响见图4～图6。

图4 发酵时间与发酵温度交互作用 对豆豉纤溶酶活性的响应面曲线Fig.4 Response surface plot of interaction between fermentation time and fermentation temperature to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans

注：固定水平为接种量0.1%。

由图4可知，发酵温度较发酵时间坡度更为陡峭，发酵温度的影响大于发酵时间。

图5 发酵温度与接种量交互作用对豆豉纤溶酶 活性的响应面曲线Fig.5 Response surface plot interaction between fermentation temperature and inoculation amount to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans

注：固定水平为发酵时间5 d。

由图5可知，发酵温度与接菌量的交互作用不明显。

图6 发酵时间与接种量交互作用对豆豉纤溶酶 活性的响应面曲线Fig.6 Response surface plot interaction between fermentation time and inoculation amount to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans

注：固定水平为发酵温度35 ℃。

由图6可知，等高线为椭圆形，说明发酵时间与接种量的交互作用显著。

2.2.3 响应面验证试验

通过响应面法建立回归模型并进行优化分析后，最终确定的最佳发酵条件为发酵时间5 d，发酵温度35 ℃，接种量0.01%。按照理论最佳发酵条件进行3次重复试验，在此条件下测得的氨基酸态氮模型计算值与实际发酵产品的含量接近，豆豉纤溶酶的试验实际值略低于理论模型计算值。

表6 验证试验Table 6 Verification experiment

2.3 最优发酵条件水豆豉品质检测

阴性对照、最优条件发酵水豆豉与市售水豆豉的氨基酸态氮、总酸、还原糖含量、pH值及豆豉纤溶酶活性检测结果见表7。

表7 氨基酸态氮、还原糖、总酸、pH值、 豆豉纤溶酶活性检测结果Table 7 Detection results of amino acid nitrogen, reducing sugar, total acid, pH and fibrinolytic enzyme activity

注：ND表示未检出。

由表7可知，与阴性对照相比，最优发酵水豆豉中的氨基酸态氮、总酸、还原糖含量、pH值及豆豉纤溶酶活性均有明显上升，可见水豆豉发酵过程中，微生物作用明显，提高了蛋白质的消化率，也产生了有营养价值的豆豉纤溶酶。最优条件发酵水豆豉的豆豉纤溶酶活性约为市售水豆豉的400倍，但是氨基酸态氮含量和还原糖含量仍较低，提示水豆豉的发酵仍不够充分。

3 结论

用贝莱斯芽孢杆菌接种黄豆发酵水豆豉，经单因素法发酵试验对五水平的发酵温度、发酵时间和接菌量进行测定后，将发酵条件范围缩小至发酵时间3～5 d，发酵温度35～40 ℃，接菌量0.01%～0.1%。根据响应面法Box-Behnken模型按照三因素三水平设计获得17种发酵条件进行试验，经优化分析后最终确定的最优发酵条件为：时间5 d，温度35 ℃，接种量0.01%。最终发酵产物初步符合提高营养价值的要求，但在发酵程度上仍有一定的改进空间。