现代分子生物学技术在环境微生物领域的应用

曹 雨

（沈阳建筑大学 市政与环境工程学院，辽宁 沈阳 110168）

随着水体污染的加重，水体中有机污染物的降解成为人们关注的热点问题。作为降解有机污染物质的主力军——微生物，其物种多样性及群落结构对生态环境均会造成一定的影响。为了更好地了解微生物的状态、确保生态环境安全、改善生态环境质量，将现代分子生物学技术引入到环境工程微生物领域中。

现代分子生物学技术，即通过对分子水平的线性结构进行检测，进而比较各个物种、细胞的生理状态。May等［1］构建了含有引物结合位点的合成DNA片段，用于定量分析10种不同的微生物；Zabkiewicz等［2］使用基于16S rRNA基因的序列分析的方法，确定从外生菌根和桦树根部分离的细菌种类。武志华等［3］采用PCR-DGGE技术分析内蒙古西部地区土壤细菌的多样性，为未来该地区的细菌资源开发利用及生态系统的稳定性提供基础数据。

现如今广泛应用的现代分子生物学技术有Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、

荧光原位杂交技术、基因芯片、qPCR技术及高通量测序技术等［4］，这些技术在分析微生物多样性、判别微生物种类、降解有机污染物等方面发挥着重要作用。

1现代分子生物学技术

1.1核酸杂交技术

核酸杂交技术是通过核酸分子杂交检测靶序列，进而可以定量或定性检测DNA序列片段。随着核酸杂交技术不断的完善，在此基础上，又形成了一系列衍生技术。

印迹杂交技术根据所分析的物质是DNA还是RNA，分为Southern印迹杂交和Northern印迹杂交，这种杂交技术多用于染色体检查等生物领域。原位杂交可以准确地对核酸序列进行定位，有利于分析微生物种类多样性。在原位杂交的基础上，用荧光进行标记，便形成了新的杂交方法——荧光原位杂交。由于荧光原位杂交具有定位准确、特异性好等优点，因此在环境微生物领域中应用的最为广泛［5］。

1.2基因芯片技术

基因芯片又称生物芯片，是20世纪80年代中期发展起来的，通过检测杂交信号强度，从而得出分子信息的一种技术。基因芯片的分类方式和种类多种多样，可分为原位合成、DNA微阵列［6］、无机片基等。在微生物群落和多样性的研究中，多采用系统寡核苷酸芯片、群落基因组芯片及宏基因组芯片［7］。除此之外，基因芯片还大范围地应用于食品、药物、机械、航天、农作物优选等领域。尽管基因芯片技术已经得到了良好的发展，但仍有一些目前无法解决的难题，如它的成本高、灵敏度较低、重复性差、操作复杂等，使得它很难对大量信息进行解读。这些问题通过样品的制备、探针固定、数据读取及分析等几个方面反映出来。

1.3 PCR技术

PCR技术，又称为多聚酶链式反应，是现代分子生物学技术中的一种。这种体外DNA扩增技术不仅灵敏度高，而且反应快速。随着PCR技术的不断完善，形成了定量实时PCR（qPCR）、PCR基因测序、PCR-SSCP、PCRDGGE、PCR-RFLP等一系列衍生技术，并在环境微生物领域发挥着重要的作用。qPCR作为检测和量化目标微生物的工具，已被广泛应用于环境微生物生态学研究中，以便于更好地理解废水中微生物群落的复杂性［8］。定量实时PCR可提供比其他分子技术更加具体、准确的定量，但在实际中应用时仍需要考虑一些必要的限制；PCR-SSCP分析技术可使构象上有差异的分子进行分离，而且这种技术的操作过程简单、反应快速、灵敏，毋需其他特殊的仪器；PCR-DGGE则是将序列不一样的DNA分开；PCR-RFLP技术，即通过特异性内切酶消化切割成不同长度的DNA片段条带。这种技术操作方法简单、DNA的含量也得到了很大的提高。Shannon等 采用实时定量PCR（qPCR）检测城市污水处理的五个阶段。实验结果发现，这种qPCR方法可有效地检测废水中的病原体。

1.4高通量测序技术

高通量测序技术的出现和日趋成熟，为微生物领域研究的深入开展提供了契机［10］。1975年桑格和考尔森开创了链终止法，两年后，桑格测定了第一个基因组序列，这便是第一代DNA测序技术。第一代测序技术的准确性可达到99%以上，但它的测序成本高、通量低，这些缺点使它难以进行大规模的应用。因此，它并不是十分理想的测序技术。经过技术的研发和改进，第二代测序技术应运而生了。与第一代测序技术相比，第二代测序技术在保持高准确性的前提下，降低了测序成本，并且提高了测序速度。近几年，测序技术不断地完善，逐步形成第三代测序技术。与前两代测序技术相比，它的最大特点是无需进行PCR扩增。不进行PCR扩增，是为了在保持第二代测序技术优点的基础上，避免因PCR所导致的系统错误。因为高通量测序的快速发展，使得对数百万个PCR扩增子进行测序得以实现。基于DNA多样性的高通量测序技术可对难以观测的水环境微生物及其群落进行观测，在生物研究中发挥着重要作用［11］。

2在环境工程微生物领域中的应用

2.1对微生物多样性的分析

现代分子生物学技术可以对微生物的结构、种类、群落进行分析。Moreno等［12］使用扩增子长度异质性PCR（LH-PCR）评估土壤中的微生物群落变化；王靖淇等［11］采用高通量测序技术对辽河真核浮游藻类的群落结构特征进行研究，研究结果表明，应用高通量测序技术观察到的优势群落与应用光学显微镜观察到的一样，均为硅藻门和绿藻门，并且高通量测序技术在观测过程中不会丢失种类信息，使测序结果更加准确；为了对处于不同培养阶段的微生物的种群结构进行测定，姚倩等［13］采用荧光原位杂交技术进行研究。在刚接种的活性污泥中，研究发现，硝化菌所占的比例仅为总微生物量的二十分之一，其中氨氧化细菌约占硝化菌的二分之一；随着硝化菌富集培养的进行，氨氧化细菌的数量逐渐减少，目标微生物硝化菌的份额逐步提高，成为优势种群。除此之外，还可以通过对微生物结构进行改变，使其更有利于研究、应用。根据细菌rRNA的基因序列Zhang等［14］设计特异性引物，从而获得可变和相邻的基因序列，提高物种水平的细菌鉴定分辨率。

2.2对污染物的降解

利用现代分子生物学技术，研究微生物分解有机污染物的过程，通过适当的技术手段，使其在最佳的试验条件下达到更高的去除率。Ge等［15］利用实验室规模的序批式反应器，应用荧光原位杂交技术评估污泥中微生物的比例，对提高废水中生物除磷效率进行研究，从而得到最佳的试验条件。以西安市第三污水处理厂为研究地点，以氧化沟工艺为研究对象，采用荧光原位杂交技术，彭党聪等［16］研究温度对强化除磷性能的影响。

2.3分析结果的技术手段

作为分析手段，现代分子生物学技术广泛的应用于各项实验中。为了检测阿留申貂病毒对农场造成的污染，Prieto等［17］采用qPCR技术对几个环境样品进行检测；Aydin等［18］采用定量实时PCR技术用于确定不同抗生素组合对总细菌、活性细菌及古细菌等的影响；GAN等［19］为了对天然群落中的有毒和无毒微囊藻进行分析，采用荧光原位杂交（FISH）和流式细胞仪（FCM）相结合的分析方法，并量化大量存在的有毒微囊藻的百分比。研究结果表明，FISH和流式细胞术的结合是研究微囊藻毒素生产生态学和对有毒微囊藻提供早期预警的有用方法；姚倩等［20］对污水处理厂活性污泥系统中的硝化螺菌富集培养进行研究，杂交结果表明，硝化螺菌占活性污泥总微生物量的四分之三左右，而硝化杆菌所占的比例很小，仅为0.1%；Zhou等［21］为了检测一般和特定的厌氧氨氧化菌细菌群，提供了针对不同环境样品的PCR引物以及针对不同目的选择合适的引物对的实际应用指导。

3结语与展望

（1）现代分子生物技术为环境工程微生物领域提供了分析技术支撑，使深入探究微生物的多样性以及微生物与污染物之间的关系成为可能。

（2）现代分子生物技术在检测过程中可得到准确的检测结果，若将现代分子生物技术与其他的环境检测技术相结合，可使得到的结果更加准确、更加可靠。

（3）在小范围内，通过现代分子生物学技术可以改变微生物的结构，使其变得更易于处理污染物。但如何大规模的利用现代分子生物技术对微生物进行操作、如何高效快速地降解有机污染物，这应是未来的研究方向。