干扰素α对ph阴性骨髓增殖性肿瘤患者血清JAK2、CALR基因表达的影响

罗爽， 花京剩

台州市立医院血液肿瘤内科(浙江台州 318000)

骨髓增殖肿瘤属于一种恶性克隆性造血干细胞疾病，患者主要的临床特征是骨髓造血增殖失调，造成外周血粒细胞、血小板、红细胞数量显著增加，患者也容易发生多部位血栓、急性白血病等，骨髓增殖肿瘤会导致细胞成熟分化出现障碍，严重影响患者的生存质量[1-2]。相关研究指出，骨髓增殖肿瘤在老年人群中发病率高，患者首发症状不明显，未见特异性，主要表现为头昏和乏力、肝脾肿大、血栓产生[3]。典型的ph阴性骨髓增殖肿瘤主要有真性红细胞增多症、原发性血小板增症以及原发性骨髓纤维化。ph染色体BCR/ABL融合基因主要在慢性粒细胞白血病患者中体现，具有特异性，在发病机制中发挥重要作用[4]。JAK2属于一种组成性酪氨酸激酶，主要作用是激活JAK-STAT信号通路。相关研究指出，70%的JAK2基因突变ph阴性骨髓增殖性肿瘤患者中会发生CALR基因突变[5]。丁莉等[6]研究指出，干扰素α对三系血细胞有降低作用，在治疗骨髓增殖肿瘤方面，效果显著。本文旨在研究干扰素α对ph阴性骨髓增殖性肿瘤患者血清JAK2、CALR基因表达的影响，为临床治疗ph阴性骨髓增殖性肿瘤提供数据参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年8月至2018年8月在我院就诊的52例ph阴性骨髓增殖性肿瘤患者，男30例，女22例，年龄45～78岁，平均(58.2±10.6)岁。按照随机数字表法分为对照组和干扰素α组各26例。对照组患者男15例，女11例，年龄(58.8±10.6)岁；干扰素α组患者男15例，女11例，年龄(58.6±10.2)岁。两组患者在性别、年龄等一般临床资料比较中，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入标准和排除标准 纳入标准：所有患者均符合WHO关于ph阴性骨髓增殖性肿瘤的诊断标准。排除标准：患自身免疫性疾病、病毒学肝炎患者；本次实验前使用免疫抑制剂治疗患者；治疗前干扰素α抗体阳性患者。本研究患者及其家属均知情，签署知情通知书。

1.3 主要试剂 羟基脲片(生产厂家：齐鲁制药有限公司，生产批号：国药准字H37021289)；聚乙二醇干扰素α-2b注射液(生产厂家：厦门特宝生物工程股份有限公司，生产批号：国药准字S20160001)。

1.4 方法

1.4.1 治疗方法 对照组患者口服羟基脲进行治疗，初始计量为15～20 mg/kg，1次/d，根据患者的治疗效果以及患者临床反应，血象恢复正常后使用0.25～0.5 g进行维持治疗，1次/d，同时每天口服100 mg阿司匹林进行辅助治疗。干扰素α组患者给予干扰素α-2b治疗，初始计量为30～50 μg/d，患者症状缓解后隔天1次治疗，逐渐减少每周1～2次维持治疗。同时每天口服100 mg阿司匹林进行辅助治疗。

1.4.2 荧光定量检测JAK2、CALR基因突变 采集每例患者空腹静脉血液样本5 mL，置于一次性真空无抗凝剂的采血管中，使用Ficoll液分离单个核细胞。TRIzol提取细胞RNA，经过电泳检测RNA并定量，经过逆转录合成cDNA。之后进行实时荧光定量PCR实验，探针或SYBR 反应25 μL，反应条件满足：94℃ 5 min,94℃ 45 s,60℃ 1 min,40个循环,设置标准组和空白对照。将PCR反应实验前3～15个循环荧光信号作为荧光本底信号，调节基线，使用JAK2、CALR基因突变率：1/1+2(野生型Ct-突变型Ct)。

1.4.3 外周血血细胞检测 采用流式细胞仪，将采集到的标本，将细胞浓度调整到1×106个/mL(10% FCS和RPMI 1640稀释)，之后1 000 r/min离心，时间为5 min，去除上清液。使用PBS缓冲液清洗2～3次，使用70%冷乙醇(1 mL)固定，-20℃过夜保存。离心之后去除固定液，加PBS缓冲液(3 mL)重悬时间为5 min。使用Rnase试剂(100 μL)，37℃进行水浴时间为30 min，之后使用PI(1 mL)细胞染色，4℃进行避光孵育，时间为30 min。分析白细胞、血红蛋白、血小板计数。

1.4.4 临床症状评分 观察两组患者在治疗过程中出现的疲劳、活力不佳、腹部不适、注意力不集中、夜间盗汗、瘙痒、发热、骨痛、体重减轻9项临床症状，每项分数为0～10分，0分表示无，10分表示严重，分数越低，说明患者症状越轻。

1.4.5 治疗总有效率、并发症发生率统计 患者治疗效果分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD)。CR是指患者JAK2、CALR基因突变下降比例，白细胞、血红蛋白、血小板计数下降>50%；PR是指患者JAK2、CALR基因突变下降比例，白细胞、血红蛋白、血小板计数降低20%～50%；SD是指JAK2、CALR基因突变下降比例，白细胞、血红蛋白、血小板计数降低0～20%；PD是指患者白细胞、血红蛋白、血小板计数，JAK2、CALR基因突变未下降。治疗有效率=(CR+PR)/总例数×100%。观察两组患者在治疗过程中出现的肌肉酸痛、嗜睡、消化道出血、血栓形成等并发症，统计患者并发症发生率。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行分析，其中计数资料采用百分率描述，组间比较采用2检验，计量资料采用进行描述，治疗前后比较采用重复测量资料方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干扰素α对患者JAK2、CALR基因突变下降的影响 对照组和干扰素α组患者治疗前JAK2、CALR基因突变比比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者治疗后JAK2、CALR基因突变比低于治疗前(P<0.05)，干扰素α组治疗后JAK2、CALR基因突变比表达低于对照组治疗后，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

项目对照组(n=26)干扰素α组(n=26)t值P值JAK2基因突变比 治疗前68.36±11.9368.25±12.120.0330.974 治疗后16.33±3.899.28±1.573.8150.001CALR基因突变比 治疗前69.75±12.5869.16±11.920.1740.863 治疗后16.89±4.898.68±2.627.5460.001

2.2 干扰素α对患者外周血血细胞的影响 对照组和干扰素α组患者治疗前白细胞、血红蛋白、血小板计数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者治疗后白细胞、血红蛋白、血小板计数低于治疗前(P<0.05)，干扰素α组治疗后白细胞、血红蛋白、血小板计数低于对照组治疗后，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

项目对照组(n=26)干扰素α组(n=26)t值P值白细胞(×109·L-1) 治疗前15.26±5.1415.49±5.020.1630.871 治疗后8.75±2.446.33±1.084.6240.001血红蛋白(g/L) 治疗前127.82±30.16128.02±30.090.0240.981 治疗后100.61±10.8685.36±8.665.5980.001血小板(×109·L-1)治疗前1067.75±60.351057.96±60.480.5840.562治疗后957.82±50.66890.36±30.625.8110.001

2.3 干扰素α对患者临床症状评分的影响 对照组和干扰素α组两组患者治疗前临床症状评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者治疗后临床症状评分低于治疗前(P<0.05)，干扰素α组治疗后临床症状评分低于对照组治疗后，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4 干扰素α对患者治疗总有效率的影响 干扰素α组患者治疗总有效率为84.62%,高于对照组患者的53.85%，差异有统计学意义(2=5.778,P<0.016)。见表4。

2.5 干扰素α对患者并发症的影响 干扰素α组患者并发症发生率为7.69%，低于对照组患者的30.77%，差异有统计学意义(2=4.457,P=0.035)。见表5。

3 讨论

ph阴性骨髓增殖性肿瘤患者主要表现的临床症状包括乏力、头晕、视觉异常、血栓栓塞等，大部分患者在发病时无症状[7]。相关研究指出，干扰素在临床试验中治疗BCR/ABL阴性骨髓增殖性肿瘤效果显著，主要作用是通过抑制巨核细胞产生，降低红系集落细胞形成，达到缓解分子生物学作用[8-9]。

目前JAK2突变检测是ph阴性骨髓增殖性肿瘤诊断的重要途径，成为ph阴性骨髓增殖性肿瘤患者靶向治疗的有效靶点[10]。CALR基因主要在内质网中表达，与钙通道结合，具有高度保守性，主要作用是在蛋白质折叠过程中发挥重要作用，有助于细胞内钙离子稳定，并且在免疫反应、细胞增殖、凋亡以及细胞吞噬和纤维化过程中，意义重大[11]。有研究指出，长时间使用干扰素治疗真性红细胞增多症，能够降低JAK2V617F表达，有助于延长患者生存时间[12]。干扰素在骨髓增殖性肿瘤治疗中，患者临床缓解率较高，降低患者急性白血病发生率，促进JAK2基因突变转阴[13]。

表3 两组患者临床症状评分比较 分

表4 两组患者治疗总有效率比较

表5 两组患者并发症发生情况比较 例(%)

本研究结果显示，经过治疗后两组患儿JAK2基因突变比降低，其中干扰素α组患者治疗后JAK2基因突变比降低明显，说明干扰素α治疗ph阴性骨髓增殖性肿瘤能够降低JAK2、CALR基因突变比。赵亚玲[14]在研究中指出，干扰素α在治疗JAK2V617F阳性骨髓增殖性疾病中，能够降低JAK2基因获得性突变，改善JAK2基因表达，本研究结果与其保持一致。相关研究指出，外周血细胞在患者疾病中水平不同，在同一疾病患者血细胞中一系、两系外周血细胞增生异常，也会对其他系外周血细胞产生影响[15-16]。本研究结果显示，经过治疗后两组患者白细胞、血红蛋白、血小板计数降低，其中干扰素α组治疗后白细胞、血红蛋白、血小板计数显著降低，说明干扰素α治疗ph阴性骨髓增殖性肿瘤能够降低患者白细胞和血小板数量，改善患者血红蛋白水平。权学莲等[17]在研究中指出，扶正清髓汤治疗BCR/ABL阴性的骨髓增殖性肿瘤,患者白细胞计数、血红蛋白、血小板计数均降低，本文研究结果与其保持一致，说明采用干扰素α治疗也能达到相同的治疗效果。

本研究数据显示，经过治疗后两组患者疲劳、活力不佳、腹部不适、注意力不集中、夜间盗汗、瘙痒、发热、骨痛、体重减轻等临床症状降低，其中干扰素α组患者较低，说明干扰素α治疗ph阴性骨髓增殖性肿瘤有助于改善患者临床症状，促进患者早期康复。干扰素在临床中主要治疗淋巴瘤、白血病以及多种肿瘤疾病，并且治疗效果显著。本研究结果显示，干扰素α组患者治疗总有效率较高，说明干扰素α能够提高ph阴性骨髓增殖性肿瘤治疗效率。与丁莉等[18]研究结果保持一致。相关研究指出，ph阴性骨髓增殖性肿瘤治疗主要以降低患者血栓为根本[19-20]。本研究数据中，干扰素α组患者无血栓形成病例，并发症发生率较低，说明干扰素α治疗ph阴性骨髓增殖性肿瘤能够降低患者并发症发生率，临床治疗较为安全。

综上所述，干扰素α对ph阴性骨髓增殖性肿瘤患者治疗效果显著，降低JAK2、CALR基因突变比，改善患者临床症状，减少患者并发症发生，临床治疗较为安全。