枸杞果酒澄清工艺优化及其稳定性研究

李亚辉，邹丹丹，梁颖，王英，周剑忠，*，蒲青

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京210014；2.南京农业大学食品科学技术学院，江苏南京210095；3.江苏省农业科学院农产品安全与营养研究所，江苏南京210014；4.青海昆仑河枸杞有限公司，青海海西816102）

枸杞（Lycium barbarum）是被子植物门茄科枸杞属的一种多刺植物，枸杞主要有宁夏枸杞和中华枸杞[1]，主要分布于我国西北地区。枸杞果实含有枸杞多糖、甜菜碱、枸杞色素等，对人体有促进免疫、抗衰老、抗疲劳、抗辐射等功能，是药食两用植物，具有较高营养和药用价值[2-3]。枸杞以干品流通，亦可进行深加工，目前，常见的枸杞深加工产品主要有枸杞果干、枸杞果汁和枸杞果酒等[4-5]。

枸杞果酒保留了枸杞自身的营养价值，便于人体吸收，是贫血、睡眠质量不佳等人群的最佳选择[6-7]。目前，枸杞果酒的酿造主要是参照葡萄酒的酿造方法，其生产工艺尚未成熟，生产中还存在很多技术问题[8-10]，浑浊沉淀是枸杞果酒储存过程中常见的问题，其大大影响了枸杞果酒的商品形象[11]，澄清稳定处理是解决果酒浑浊沉淀的主要技术方法。澄清是指通过处理使果酒具有一定的澄清度，稳定则是以澄清为基础，通过处理使果酒保持已有澄清度，处于稳定状态再无新的浑浊沉淀生成[12-13]。目前对果酒的澄清处理方法有过滤、自然澄清、下胶和离心等，稳定处理方法有冷处理、热处理和添加稳定剂等[14-15]。通过添加澄清剂对果酒进行下胶是目前应用最多的澄清方法，王英等优化了壳聚糖对黑莓干红的澄清处理条件[16]；夏其乐等研究了明胶对杨梅露酒澄清度的影响[17]；牛广财等对比了皂土和壳聚糖对沙棘果酒的澄清作用效果[18]；忻胜兵等研究了皂土-蛋清复合澄清剂对海红果酒的澄清效果[19]。果酒不同所用澄清剂不同，其达到的澄清效果也不同。

本试验在筛选出最佳澄清剂的基础上，通过响应面优化其澄清条件，同时对枸杞果酒的冷稳定性、热稳定性和微生物稳定性进行研究，以期找到有效的澄清稳定处理方法，为枸杞果酒生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞果酒：江苏省农业科学院农产品加工研究所酿制；壳聚糖：南通绿神生物工程有限公司；交联聚乙烯基吡咯烷酮（crosslinking poly vinylpyrrolidone，PVPP）、皂土、0.45 μm 有机滤膜：上海杰兔工贸有限公司；明胶：漯河市五龙明胶有限公司；NaOH 标准溶液（0.01 mol/L）、I2标准溶液（0.05 mol/L）：深圳市博林达科技有限公司。

1.2 仪器与设备

JA203 分析天平：天津市精拓仪器科技有限公司；WS 手持糖度计：北京测维光电仪器厂；UV-1100 分光光度计：上海美普达仪器厂；JA3003 精密电子天平：上海衡平仪器仪表厂；TGL-20M 冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；501A 水浴锅：上海试验仪器厂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞果酒酿造工艺及要点

1.3.1.1 酿造工艺流程

枸杞果酒的酿造工艺流程如图1 所示。

图1 枸杞果酒酿造工艺流程Fig.1 Technological process of wolfberry wine

1.3.1.2 操作要点

1）制浆：取一定量的干制枸杞，加入其质量4 倍的水，浸泡40 min，再将其煮沸10 min，冷却后打浆，得枸杞浆。

2）酶解：加入枸杞浆质量0.002%～0.005%的果胶酶，在 30 ℃～40 ℃酶解 2 h～3 h。

3）调配：调节果浆pH 值为4.5，加入蔗糖调整其糖度为20 Brix，加入偏重亚硫酸钾150 mg/L 混匀。

4）酵母活化：称果浆质量0.05%的酿酒酵母DV10，放入4%的葡萄糖水中在38 ℃下活化0.5 h～1 h。

5）发酵：将活化的酵母接入果浆、混匀，在25 ℃下发酵，每天搅拌一次，每天测其中的糖含量，待糖含量小于4 g/L 时，发酵停止。

6）过滤：用无菌纱布将枸杞酒中的大颗粒固体物质除去。

7）膜滤：将下胶处理后的枸杞酒用0.45 μm 有机膜过滤除菌。

1.3.2 枸杞果酒理化指标测定

总糖、总酸、酒精度、总SO2和游离SO2含量测定参照国标GB 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》所述方法；澄清度测定参照徐春等方法[20]，以蒸馏水为空白对照，以680 nm 下透光率表示澄清度。

以上每个样品均重复3 次。

1.3.3 澄清剂及澄清条件优化

1.3.3.1 澄清剂的配置

1%的明胶溶液、1%的壳聚糖溶液、皂土和PVPP溶液配置参照李亚辉等所述方法[21]。

1.3.3.2 澄清剂的选择

分别以明胶、壳聚糖、PVPP 和皂土为澄清剂对枸杞果酒进行下胶，测定每种澄清剂不同下胶量对枸杞果酒澄清度的影响。下胶后20 ℃静置10 d，取上清，测定其在680 nm 下透光率表示澄清度。试验重复3 次结果取平均值。不同澄清剂添加量如表1 所示。

表1 澄清剂及其添加量Table 1 Clarifying agent and addition amount

1.3.3.3 澄清条件单因素试验

根据澄清剂筛选结果，以澄清效果最好的皂土为澄清剂对枸杞果酒进行澄清处理。取一定量浸泡好的皂土在搅拌状态下加入到0.5 L 枸杞酒中，使其混合均匀，在一定温度下静置一段时间，取上清液测其在680 nm 下透光率表示澄清度。按此方法分别研究了皂土用量、澄清时间和澄清温度对枸杞酒澄清度的影响。单因素试验设计及处理条件见表2。每个单因素试验平行重复3 次，结果取平均值。

表2 单因素试验设计Table 2 Experimental design for single factor

1.3.3.4 澄清条件的优化

在单因素试验结果基础上，采用Box-Behnken 设计，以澄清度（680 nm 处透光率）为响应值，以皂土用量、澄清时间和澄清温度为影响因素，以-1，0，+1 分别代表自变量的低、中、高3 个水平，利用响应面分析对其澄清条件进行优化。响应面设计因素和水平表见表3。

表3 响应面设计因素水平表Table 3 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 稳定试验

1.3.4.1 冷处理

枸杞果酒澄清处理后（按1.3.3 化条件进行）用0.45 μm 滤膜过滤、装瓶，然后分别置于-4、0 ℃和 4 ℃恒温冰箱中静置10 d，以置于常温下样品为对照，取出样品依次在 40、30、20、10、0 ℃各放置 1 周后，观察样品是否有浑浊沉淀，并测定其在680 nm 处的透光率表示澄清度。

1.3.4.2 热稳定性检验

将新酿造的枸杞果酒分别做如下处理：

对照：膜滤，装瓶。

处理1：装瓶加热煮沸20 min，冷却，膜滤，装瓶。

处理2：下胶澄清（按1.3.3 化条件进行），膜滤，装瓶。

处理：3：装瓶加热煮沸20 min，冷却，下胶澄清（按1.3.3 优化条件进行），膜滤，装瓶。

将对照及处理加热煮沸20 min 后常温静置7 d，观察酒体外观，并测定其在680 nm 处的透光率表示澄清度。

1.3.4.3 微生物稳定性检验

将澄清处理的枸杞果酒（按1.3.3 优化条件进行澄清处理）装瓶后，在水浴中分别加热至中心温度为60、70、80、90 ℃并保温 20 min，以未进行热处理的为对照，冷却后在常温下放置7 d，然后分别取样、平板划线，37 ℃培养48 h，记录平板上的菌落总数。

1.4 数据分析

利用SPSS18.0 和Design Expert V8.0 数据处理软件进行数据处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 枸杞果酒理化指标

枸杞果酒理化指标测定结果如表4 所示。

表4 枸杞果酒理化指标Table 4 Physical and chemical indicators of wolfberry wine

由表4 可知，总糖含量3.85 g/L 达到了干型酒的标准，总SO2含量64.24 mg/L，远远低于250 mg/L 的国家标准，游离SO2含量约为总SO2含量的2/3，澄清度较低为78.3%。

2.2 澄清剂及澄清条件优化

2.2.1 澄清剂选择

不同澄清剂对枸杞果酒的澄清效果如图2 所示。

图2 不同澄清剂对枸杞果酒的澄清效果Fig.2 Clarification effect of different clarifying agents on wolfberry wine

明胶作为果酒常用澄清剂，可与酒中单宁结合并吸附其他杂质形成沉淀[22]。由图2 可知，明胶添加量为0.04 g/L 时，澄清效果最佳。然后随着添加量增加，澄清度逐渐下降，可能是由于酒中单宁含量过少，过多明胶对酒中胶体物产生保护作用，导致澄清度下降。壳聚糖具有良好的絮凝效果，可使酒中小颗粒悬浮物聚集并沉淀，从而使酒达到澄清的效果[23]。由图2 可知，当壳聚糖添加量为0.3 g/L～0.4 g/L 时澄清效果最好，当大于此添加量时，澄清度逐渐下降。这可能是因为壳聚糖本身有较强的黏性，过多添加时，使酒体形成一种稳定的体系，不利于果酒的澄清。PVPP 对酒中多余的酚类物质和可溶性蛋白有较强的吸附力[24]。由图2 可看出，在一定用量范围内PVPP 可提高枸杞果酒的澄清度，添加量为0.3 g/L 时澄清度最高，继续加入，澄清度开始降低。皂土也为果酒常用澄清剂，其吸水后膨胀变得疏松多孔，形成带负电荷的胶体，可与酒中带正电荷的浑浊物絮凝成沉淀，从而使果酒澄清[24]。由图2 可知，在低添加量时澄清度随皂土用量的增加而升高，添加量为0.6 g/L 时澄清度最高，然后随着添加量的增加澄清度几乎没有变化。整体来看，4 种澄清剂都能不同程度的提高果酒澄清度，其中以皂土效果最好，且皂土价格便宜，因此选择皂土作为枸杞果酒的最佳澄清剂。

2.2.2 澄清条件单因素试验

皂土用量、澄清时间和澄清温度对枸杞酒澄清度的影响分别如图3、图4 和图5 所示。

图3 皂土添加量对枸杞酒澄清度的影响Fig.3 Effect of bentonite amount on clarity of wolfberry wine

图4 澄清时间对枸杞酒澄清度的影响Fig.4 Effect of clarification time on clarity of wolfberry wine

图5 澄清温度对枸杞酒澄清度和色度的影响Fig.5 Effect of clarification temperature on clarity of wolfberry wine

皂土是铝的自然硅酸盐，可固定水而明显增加自身体积，在电解质溶液中可吸附蛋白质和色素而产生胶体的凝聚作用，因此皂土可用于果酒的澄清处理。由图3 可知，澄清度随着皂土添加量的增加逐渐升高，添加量为0.6 g/L 时澄清度最高，然后随着添加量增加澄清度逐渐下降。由图4 可知，澄清时间至少达到10 d时才能具有较高澄清度，继续延长澄清时间对澄清度没有显著影响。由图5 可知，在10 ℃到20 ℃温度范围内进行澄清处理可达到较高澄清度，大于20 ℃时澄清度开始明显降低。由图3～图5 结果可看出：皂土用量、澄清时间和澄清温度对枸杞酒澄清度都有不同程度的影响；考虑到时间成本和温控成本，选择最佳澄清时间为10 d，选择最佳澄清温度为20 ℃。

2.2.3 澄清条件优化

2.2.3.1 数学模型建立及方差分析

根据单因素试验结果，以皂土用量（A）、澄清时间（B）和澄清温度（C）为影响因素，以澄清度（Y）为响应值，设计三因素三水平响应面试验，Box-Behnken 试验结果见表5。

表5 响应面试验设计及结果Table 5 Design and results of response surface methodology

采用Design-Expert V8.0.6.1 软件对试验结果进行多元回归拟合，得到澄清度的二次多项回归模拟方程如下：Y=91.8+1.63A-0.36B-1.26C-0.33AB-0.43AC-0.85BC-4.6A2-1.43B2-1.67C2。

用Design-Expert V8.0.6.1 软件对表5 进行回归模型方差分析，结果见表6。

表6 回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance for the response surface model

由表6 可知：A 和C 对澄清度有极显著影响（P＜0.01），而 B 对澄清度无显著影响（P＞0.05）。这说明皂土用量和澄清温度是澄清度的主要影响因素，澄清时间对其影响较小。二次项 A2、C2极显著（P<0.01），B2不显著（P＞0.05），交互项 BC 极显著（P<0.01）。响应面建立的二次回归模型极显著（P＜0.01），且失拟项不显著（P＞0.05）；该模型R2=0.991 0、校正决定系数=0.979 3，表明该模型预测值与试验值有较好的拟合度，说明可用此模型分析枸杞果酒的最佳澄清条件。

2.2.3.2 响应面分析及优化

皂土用量、澄清时间和澄清温度相互交互作用对枸杞果酒澄清度的影响如图6～图8 所示。

图6 皂土用量和澄清时间对澄清度的影响Fig.6 Effects of bentonite amount and bentonite treatment time on clarity

图7 皂土用量和澄清温度对澄清度的影响Fig.7 Effects of bentonite amount and bentonite treatment temperature on clarity

由图6、图7 和图8 可知，任何两个交互因素的响应面都存在最高点，其中澄清时间和澄清温度的交互作用影响比较明显。通过Design-Expert V8.0.6.1 软件分析优化得到，获得最高澄清度时的最佳澄清条件是皂土用量0.64 g/L，澄清时间9.2 d，澄清温度20.5 ℃，在此条件下枸杞果酒的澄清度为92.8%。为了验证所得方程可行性，对所得最佳澄清条件进行了验证试验。在皂土用量、澄清时间和澄清温度分别为0.6 g/L、9 d 和20 ℃下进行3 次平行试验，所得澄清度（91.3±0.21）%，与预测值的相对误差为1.62%，说明优化结果可靠。

图8 澄清时间和澄清温度对澄清度的影响Fig.8 Effects of bentonite treatment time and treatment temperature on clarity

2.3 稳定试验

2.3.1 冷处理

冷稳定试验结果如表7 所示。

表7 冷处理试验结果Table 7 Result of cool treatment

冷处理是指使酒在低温下放置一定时间，冷处理可使酒体达到稳定状态保持较好澄清度。由表7 可知，在不同温度放置后对照酒体浑浊且有沉淀产生，澄清度大大降低，说明未进行冷处理的酒体稳定性差，不能较好的保持原有澄清度。-4 ℃处理的样品稳定性较好，在不同温度下放置后酒体仍澄清透亮，依然保持较高澄清度；其次是0 ℃处理的样品；4 ℃处理的样品有浑浊产生，澄清度有明显降低。

2.3.2 热稳定性检验

对于甜型和半甜型果酒加热杀菌是生产中必要的步骤。果酒中含有大量蛋白质、色素和多酚等热敏性物质，加热后往往产生浑浊沉淀[25]。本试验对枸杞果酒进行不同处理后，检验其热稳定性，结果如表8所示。

由表8 可知，对照加热后酒体浑浊且产生大量絮状沉淀，澄清度显著降低，说明枸杞果酒热稳定性较差；处理1 加热处理和处理2 下胶处理可从一定程度上缓解枸杞酒的热不稳定性，但加热后仍有浑浊沉淀产生，且澄清度下降，说明仍然存在热不稳定性；处理3 在加热处理基础上进行下胶处理，加热后酒体澄清透亮且具有较高澄清度，说明经此处理后枸杞果酒具有较好的热稳定性。

表8 热稳定性检验Table 8 Result of thermal stabilization

2.3.3 微生物稳定性检验

枸杞果酒微生物稳定性检验结果如图9 所示。

图9 微生物稳定性检验Fig.9 Result of microbial stabilization

对于部分低酒精度果酒和甜型、半甜型果酒，为保证其微生物安全性，加热杀菌是必要步骤[26]。由图9可知，未进行杀菌的对照组有较高的菌落总数；在60 ℃和70 ℃温度下处理后，菌落总数有显著降低，但未完全达到无菌状态；在80 ℃和90 ℃温度下处理后，菌落总数为0，可达到较好的微生物稳定性。考虑到经济成本和过高温度对酒品质的影响，因此选择最佳杀菌温度为80 ℃。

3 结论

本文以澄清度为指标，对枸杞果酒的澄清剂选择、澄清处理和稳定处理方法进行了研究。结果表明：皂土下胶可获得较高澄清度，为枸杞果酒最佳澄清剂；利用皂土澄清的最佳条件为，皂土添加量0.6 g/L、澄清时间9 d、澄清温度20 ℃，在此条件下，枸杞果酒的澄清度为91.3%；在-4 ℃下处理10 d 可使枸杞果酒获得较好的稳定性，瓶储中保持较高的澄清度，无浑浊沉淀产生；加热处理后进行下胶处理，可使枸杞果酒获得较好的热稳定性；80 ℃杀菌20 min 可使枸杞果酒达到较好的微生物稳定性。