龙山地区干豆豉真菌多样性研究

倪慧，王玉荣，尚雪娇，张振东，周书楠，郭壮

（湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳441053）

豆豉，古称“嗜”或“幽菽”，是以黄豆或黑豆为主料，添加食盐、辣椒和白酒等发酵而成的一种传统特色调味制品[1]。豆豉中含有的血管紧张素转化酶抑制肽和酶提取物等具有降血压[2]、溶血栓[3]以及预防和治疗过敏性皮炎等功效[4]。我国各地一直以来都有制作和食用豆豉的习惯，不同地区制作豆豉的工艺不同，成品种类繁多，根据含水量多少或体态可将其分为干豆豉、豆豉和水豆豉，其中干豆豉是指将发酵完成的豆豉进行干燥使水分降低至35%以下的产品[5]。

除富含乳酸杆菌、乳酸球菌、葡萄球菌和芽孢杆菌等细菌外[6-7]，豆豉中富含的酵母和霉菌等真菌对产品风味品质的形成亦有着积极的作用[8]，因而对豆豉中真菌微生物多样性进行解析是极为必要的。柳陈坚等采用焦磷酸高通量测序发现云南普洱市豆豉中的真菌均为假丝酵母属（Candida）[9]；Zhang W 等采用 Illumina MiSeq 分析发现甘肃地区豆豉中的真菌有毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）和亚罗酵母属（Yarrowia）[10]；Lin Y 等采用同样的方法研究江西豆豉发酵过程中的真菌变化，发现其优势真菌属为曲霉（Aspergillus）和立克次霉属（Lichtheimia）[11]；任璐等从永川和三台毛霉型豆豉中分离出产β－葡萄糖苷酶、纤维素酶和蛋白酶能力不同的 2 株总状毛霉（Mucorracemosus racemosus）[12]。上述研究的开展，均表明豆豉中存在着丰富的真菌类群。

龙山县位于湖南省湘西土家苗族自治州北部，区位独特，具有较为独特的饮食习俗[13]。本研究以采集自湘西州龙山县传统发酵干豆豉为研究对象，采用第二代高通量测序技术对其中真菌群落结构组成进行分析，以期为当地传统发酵食品中菌种资源发掘及应用提供一定理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

干豆豉：于2018 年12 月采集自湖南省湘西土家苗族自治州龙山县中街农贸市场市场、民安镇农贸市场和步行街农贸市场，编号依次为LS1～LS5；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA 基因组提取试剂盒：德国 QIAGEN 公司；FastPfu Fly DNA Polymerase、dNTPs Mix、5×Trans StartTM、FastPfu Buffer、5×PCR Buffer：北京全式金生物技术有限公司；DNA 1000 试剂盒：美国Agilent 公司；6×Lodding Buffer：天一辉远生物科技有限公司；111860 琼脂糖：香港基因有限公司。

ND-2000C 微量紫外分光光度计：美国Nano Drop公司；5810R 台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf 公司；VeritiTM96 孔梯度PCR 扩增仪：美国AB 公司；PowerPacTMBasic 稳压仪、DCodeTMSystem、UVPCDS-8000 凝胶成像分析系统：美国BIO-RAD 公司；DYY-12 电泳仪：北京六一仪器厂；MiSeq PE300 高通量测序平台：美国Illumina 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 干豆豉样品采集及前处理

样品采集后分装在50 mL 无菌离心管中置于-80 ℃条件下备用。

1.2.2 样品微生物基因组DNA 提取

干豆豉样品微生物基因组DNA 的提取方法参照DNA 基因组提取试剂盒说明书中的操作步骤进行，并用1%的琼脂糖凝胶电泳（120 V，30 min）和微量紫外分光光度计对提取的DNA 的纯度和浓度进行检测，合格的DNA 存于-20 ℃备用。

1.2.3 真菌18S rDNA 扩增与测序

正向和反向引物分别为SSU0817F（5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’）和 SSU1196R（5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’）且在正向引物中加入核苷酸标签（Barcode）。扩增体系及程序参照胥伟等[14]和陈庆金等[15]的方法进行操作：20 μL 的扩增体系中有DNA 模板 10 ng，5×PCR Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mix 2 μL，5 μmol/L SSU0817F 和 SSU1196R 各 0.8 μL，5 U/μL DNA 聚合酶 0.4 μL 以及无菌无酶超纯水12 μL，将体系混匀后进行扩增。扩增第一步：95 ℃预变性 3 min；第二步：95 ℃变性 30 s，55 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 45 s；第三步：72 ℃维持 10 min 以使 DNA 链完全延伸，其中，第二个步骤需循环30 次。扩增产物鉴定合格且纯化后寄至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.3 数据处理与分析

将两条成对序列（reads）进行拼接，然后参照文献[16]中的方法对拼接后的序列进行质控和筛选。以Barcode 为参照将各reads 划分到不同样品中，切除Barcode 和引物，过滤短序列。利用QIIME[17]分析平台对样品中微生物多样性进行分析，用UCLUST 软件[18]将相似度不小于97%的序列划分至同一个操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）中，然后从每个OTU 中挑选代表性序列使用SILVA 数据库[19]进行物种注释。样品真菌丰度和多样性以超1 指数、发现物种数和香农指数等指表进行评估。在本研究中将样品中平均相对含量大于1.0%的真菌门或属定义为优势真菌们或属，将平均含量小于1%的真菌门或属归类于“其他的”。

利用Origin2017 和Excel 对测序结果进行统计，并绘制折线图分析测序深度。韦恩图（Veen）使用Veeny2.1.0 在线绘制（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）用于显示个样品间特有和共有的OTU 数。

2 结果与分析

2.1 测定结果统计

本研究首先以香农指数和发现物种数为参照对测序条件及深度进行评估，结果如图1 所示。

图1 香农指数曲线和稀疏曲线Fig.1 The map of Shannon index curve and rarefaction curve

由图1 可知，随着测序量的增加，香农指数逐渐增大，说明测序量越大，样品中真菌丰富度越高。与之不同的是，当测序量大到7 500 条左右时稀释曲线已逐渐趋于平稳，表明测序量足够，样品中的真菌已基本全部被覆盖。本研究从5 个传统发酵干豆豉样品中共检测出82 541 条（100%相似度）有效序列，测序深度合理，可用于进一步分析。

作为反映生态学中生物多样性的重要指标之一，超1 指数、香农指数和辛普森指数等Alpha 多样性指数常用于显示某一特定区域或生态系统内生物的均匀度和丰富度。各样品中检测出的序列数、OTU 数、超1 指数和香农指数值如表1 所示。

表1 样品真菌测序概况Table 1 Statistics analysis of sample fungal sequencing results

由表 2 可知，LS1、LS2、LS3、LS4 和 LS5 测得有效序列数分别为 43 848、55 757、44 191、53 906 和 44 293条，OTU 数分别为 1 080、1 512、1 525、1 636 和 1 361个。香农指数的值是 LS4＞LS3＞LS5＞LS2＞LS1，说明在所有样品中LS4 中真菌多样性最高，LS1 最低。超1 指数的值是 LS3＞LS5＞LS2＞LS1＞LS4，说明 LS3 中真菌丰富度最高，LS4 最低。香农指数和超1 指数的平均值分别为5.51±0.76 和4 128±332，表明龙山干豆豉中含有较为丰富的真菌菌群，且不同样品间的数目和均匀度都存在一定差异。

2.2 样品真菌OTU分析

纳入本研究的样品中检测出的82 541 条高质量序列在97%的相似水平下可归并至5 501 个OTU 中，各样品中独有或样品间共有的OTU 数如图2 所示。

图2 干豆豉中共有和独有OTU 分析Fig.2 Common and unique OTU analysis in dried douchi

由图2 可知，Veen 图重叠部分较多，各样品间存在复杂的数目不等的OTU 数，LS1～LS5 中独有的OTU数分别为 705、754、776、960 和 1 051 个，而 5 个样品中共有的OTU 数仅为113 个，但其所包含的序列数占总序列数的64.68%。这表明样品间真菌种类和数量存在较大差异但共有的真菌数量较多。这与谭强来等[20]研究的江西豆豉中的真菌OTU8 个，真菌种类较单一的结论存在一定差异。这可能是由于其采集的样品来源于食品公司，是经工业化生产而来，生产环境要比农户自制严格，从而降低了外界真菌进入产品中的可能性。

本研究进一步对核心优势OTU 在各样品中的分布情况进行统计，结果如图3 所示。

图3 核心优势OTU 在各样品中的相对含量Fig.3 The relative content of core dominant OTU in each sample

由图3 可知，在各样品中均存在且相对含量大于1.0%的OTU 即核心优势OTU 有9 个，这些OTU 在不同样品中的分布不同。在所有样品中LS1 中OTU3388的相对含量最高，OTU3018 的相对含量最低；OTU1774在LS2 和LS3 中的相对含量也要明显高于其他样品，值得注意的是LS5 中核心优势OTU 的累积相对含量要明显低于这些OTU 在其他样品中的比例。这与图2分析结果一致，即LS5 中独有OTU 数要高于其他样品。进一步对核心OUT 间的相关性进行分析，结果如图4 所示。

图4 核心OUT 相关性分析Fig.4 The correlation analysis of core OUTs

由图4 左侧和上方的聚类分析可知，样品中的9 个核心 OTU 可分为 3 个聚类，OTU3658 和 OTU5393 为一类，OTU978、OTU84、OTU1774 和 OTU3018 为一类，OTU3388、OTU93 和OTU1664 为一类。从热图中可以看出，OTU84 与 OTU3018 呈显著正相关（p<0.05），与OTU978 呈极显著正相关（p<0.001），与 OTU1774 相关性非常显著 （p<0.001）；OTU3018 与 OTU978 和OTU1774 的相关性均非常显著（p<0.01）；OTU1664 与OTU33888 呈显著正相关（p<0.05），OTU93 与 OTU3388相关性非常显著（p<0.01）；OTU978 与 OTU1774 相关性非常显著（p<0.01）；OTU5193 与 OTU3658 呈显著正相关（p<0.05）。整体而言，各核心OTU 间相关性明显，且主要呈现正相关关系。

2.3 物种注释

使用SILVA 数据库对从每个OTU 中挑选的代表性序列进行物种注释并对其微生物学分类地位进行统计，发现龙山干豆豉样品中真菌门、纲、目、科和属的数量分别为 7、13、22、26 和 31 个，各样品中优势真菌门信息如图5 所示。

图5 不同样品中各优势真菌门相对含量Fig.5 Relative content of dominant fungal phyla in different samples

LS1、LS2、LS3、LS4 和 LS5 中真菌门的数量分别为3、6、4、4 和 3 个，所鉴定出的真菌门有 Ascomycota、Basidiomycota、Mucoromycota、Zoopagomycota （捕虫霉门）、Chytridiomycota（壶菌门）和 Nucletmycea（无对应中文名），其中Chytridiomycota 和Nucletmycea 均只在LS2 中被检测出且相对含量较低，仅为0.003 %和0.002 %。由图 5 可知，Ascomycota、Basidiomycota 和Mucoromycota 的龙山干豆豉中的核心优势真菌门，三者累积平均相对含量高达96.32%。各优势真菌门在各样品中的含量存在差异，Mucoromycota 在LS3 中的相对含量为5.68 %，而在LS5 中的相对含量仅为0.01%。进一步对各样品中真菌属进行分析，结果如图6 所示。

图6 干豆豉中优势真菌属相对含量Fig.6 Relative content of dominant fungi genera in dried douchi

由图6 可知，龙山干豆豉中的优势真菌属及其平均相对含量分别为 Aspergillus（26.17 %）、Candida（12.77 %）、Trichosporon（10.40 %）、Pichia（8.56 %）、Kluyveromyces（6.56%）、Yamadazyma（5.50%）、Cryptococcus（隐球酵母属，4.76%）、Galactomyces（耐碱酵母属，3.68%）、Cladosporium（枝孢属，2.26%）、Wallemia（节担菌属，2.24%）和 Rhizopus（米根霉属，1.20%）。其中，在LS1 中未检测到Cryptococcus 和Wallemia，LS3中未检测到Cryptococcus，LS4 中未检测到Cryptococcus 和 Cladosporium。Aspergillus、Candida、Trichosporon、Pichia、Kluyveromyces、Yamadazyma、Galactomyces 和Rhizopus 作为核心优势真菌存在于所有样品中，且并未发现占绝对优势的真菌属。结合图4 可知各核心真菌间相互作用，共同形成龙山干豆豉独特品质。此外，所有样品中有14.34%的序列不能鉴定到属水平，表明该地干豆豉中仍有大量的真菌资源未被发掘。

3 结论

本研究中，从龙山干豆豉中检测出有效真菌序列82541条，划分的OTU 数为5501个。各样品中核心优势真菌门极其平均相对含量分别为Ascomycota（73.01%）、Basidiomycota（20.42 %）和 Mucoromycota（2.89 %），在发现的54 个真菌属中有8 个为核心优势真菌属：Aspergillus、Candida、Trichosporon、Pichia、Kluyveromyces、Yamadazyma、Galactomyces 和 Rhizopus。由此可见，龙山干豆豉中真菌多样性较高，后续研究中采用纯培养技术对其中蕴含的菌株进行挖掘保护，同时积极开展相关菌株的应用研究极为必要。