超声辅助离子液体提取黑豆异黄酮及其抑菌活性研究

苏适，黎莉，王双侠，王斌

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061）

黑豆是豆科植物大豆的干燥种子，味甘性平，含有不饱和脂肪酸、蛋白质、纤维素、异黄酮、多种微量元素等营养成分，其中的异黄酮类化合物[1]具有抗氧化、预防骨质疏松、治疗更年期综合症等临床应用，可作为预防和治疗疾病的保健品和药品[2-3]。天然的异黄酮资源十分稀缺，大豆是唯一含有异黄酮且含量在营养学上有意义的植物资源。现代生活中食品添加剂和抗菌类药物的使用越来越多，对异黄酮的需求也在增大。因此，对天然异黄酮抑菌作用的研究也逐渐深入。

提取异黄酮常规的方法有溶剂浸提法或超声溶剂法，提取率多在0.221%～0.488%[4-6]。离子液体是（ionic liquid）在室温下完全由离子组成的液体物质，能够吸收超声波，具有理化性质稳定、挥发性低、萃取能力好、可重复利用等性质[7-9]。李倩等[10]采用微波辅助离子液体提取葛根总黄酮，提取率为8.05%，比传统的溶剂法的提取率提高了13.5%。钟方丽等[11]采用离子液体超声辅助法提取香叶总黄酮，相比于传统的超声辅助乙醇法，总黄酮的提取率提高了35.9%。因此，本研究采用超声辅助离子液体提取黑豆异黄酮，通过响应曲面法优化提取工艺。目前，对异黄酮的研究主要集中在抗氧化性而对抑菌性研究很少，本试验初步探索了黑豆异黄酮的抑菌活性，为深入研究其生物活性提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青仁黑豆：黑龙江省；染料木素标准品（纯度98%）：中国药品生物制品检定所；1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（纯度97%）：阿尔法试剂有限公司；琼脂粉、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠（均为分析纯）：国药试剂有限公司。供试菌种：绥化学院微生物实验室提供。

1.2 试验仪器

KQ-50B 超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；101C-2B 电热鼓风干燥箱：上海市实验仪器总厂；XV-9200 紫外分光光度计：北京市精密仪器厂；SPX-150B-2 生化培养箱：海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2FD 型超净工作台：哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线

参考文献方法[6]，准确称取染料木素标准品1.0 mg，用95%的乙醇溶液配制成浓度为1 mg/mL 的标准溶液，分别移取 0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 的标准溶液，置于10 mL 的容量瓶定容，在260 nm 处测定吸光度。以金雀异黄酮的浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=0.112 6x，R2=0.997 9。

1.3.2 黑豆异黄酮的提取

黑豆粉碎→过60 目筛→按照料液比1 ∶3（g/mL）加入正己烷，脱脂2 次→离子液体-超声辅助提取→提取液离心→测定异黄酮含量。

1.3.3 提取率的计算

称取4.0 g 已脱脂黑豆粉末，加入一定浓度的离子液体，在一定条件下提取黑豆异黄酮，以5 000 r/min离心40 min，取得上层清液，按1.3.1 项下方法测定其吸光度，并根据回归方程，计算黑豆异黄酮浓度及提取率：

式中：C 为测得浓度，μg/mL；V 为定容体积，mL；n为稀释倍数；M 为原料质量，g。

1.4 提取工艺优化

称取脱脂的黑豆粉末4.0 g，采用离子液体-超声辅助法提取黑豆异黄酮，考察离子液体浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L）、超声时间（20、30、40、50、60 min）、料液比[1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）]、提取温度（30、40、50、60、70 ℃）对黑豆异黄酮提取率的影响，在单因素试验基础上设计四因素三水平试验对提取条件进行考察。

1.5 响应面试验设计

根据单因素试验，选取离子液体浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、提取温度（D），黑豆异黄酮提取率为响应值，根据Box-Behnken Design 中心组合设计原理，优化黑豆异黄酮提取工艺，以异黄酮的提取率为响应值，建立响应回归模型，因素水平见表1。

表1 响应面试验设计Table 1 Design of response surface experiments

1.6 抑菌能力测定

采用滤纸片法[12]通过抑菌圈直径的大小来判断黑豆异黄酮的抑菌活性。将短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌及大肠杆菌分别均匀涂布于培养皿中培养（37 ℃，24 h），制成含菌平板。在平板上分别放置4 个直径为6 mm 的灭菌滤纸片，向滤纸片上分别滴加浓度为 0.0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75 mg/mL 的异黄酮。用游标卡尺测定抑菌圈的直径，直径为6 mm 表示无抑菌作用，大于6 mm 则表示有抑菌作用。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 离子液体浓度对提取率的影响

不同离子液体浓度对黑豆异黄酮提取率的影响结果见图1。

图1 离子液体浓度对提取率的影响Fig.1 Effect of the concentration of ionic liquids on extraction yield

由图1 可知，随离子液体浓度增大，黑豆异黄酮的提取率逐渐增加，当离子液体浓度为0.6 mol/L 时，异黄酮提取率达到最大值，当浓度超过0.6 mol/L 时，提取率开始下降。原因可能是1-丁基-3-甲基咪唑氯盐的浓度变大，对异黄酮的溶解性也相应的提高；离子液体的浓度过高，提取液黏度也会继续增大，溶液扩散能力变差，更难渗到黑豆细胞的内部，使得离子液体对黑豆异黄酮的溶出能力降低[13]。因此，选择离子液体浓度为0.6 mol/L 进行试验。

2.1.2 提取时间对提取率的影响

不同提取时间对黑豆异黄酮提取率的影响结果见图2。

图2 提取时间对提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction yield

由图2 可知，随提取时间的延长，黑豆异黄酮提取率逐渐增加，提取时间为50 min 时，提取率达到最大值，继续延长提取时间，异黄酮提取率开始下降。原因可能是提取时间短，黑豆中有效成分不能充分浸出，提取时间的延长，在超声波空化作用和机械振动的持续作用下，黑豆异黄酮向溶剂中逐渐溶出，提取率逐渐升高。但是提取时间过长会破坏异黄酮类化合物的结构，提取率下降[14]。因此，超声时间选择50 min 进行试验。

2.1.3 料液比对提取率的影响

不同料液比对黑豆异黄酮提取率的影响结果见图3。

图3 料液比对提取率的影响Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction yield

由图3 可知，随着溶剂体积的增大，黑豆异黄酮提取率逐渐增加，当料液比为 1 ∶20（g/mL）时，提取率达到最大值，料液比超过 1 ∶20（g/mL）时，提取率开始下降。原因可能是料液比过小，提取液黏度较大，不利于异黄酮的溶出，不能保证黑豆中异黄酮转移到提取液中，提取率较低。料液比增大，大量溶剂会吸收一定的超声波，降低了超声波对细胞的破碎能力，导致细胞内异黄酮溶出减少[15]。因此，料液比选择 1 ∶20（g/mL）进行试验。

2.1.4 提取温度对提取率的影响

不同提取温度对黑豆异黄酮提取率的影响结果见图4。

图4 提取温度对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield

由图4 可知，随着提取温度的升高，黑豆异黄酮的提取率逐渐增大，当温度为60 ℃时，异黄酮的提取率最大；但温度继续升高，提取率开始下降。原因可能是随着温度升高，离子液体的运动速率和频率也不断变大，使其更容易渗透到黑豆皮组织细胞中，加速异黄酮的溶出，从而增加异黄酮的提取率。但继续升高温度，会使异黄酮结构上的酚羟基发生氧化，导致其结构被破坏，从而使提取率下降。因此，选择提取温度60 ℃进行试验。

2.2 响应面结果分析

2.2.1 响应面设计及结果

响应面试验设计方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计方案Table 2 Response surface test design scheme

2.2.2 响应面的建立与分析

采用Design-Expert8.0.6 软件对表2 中的数据进行分析，以黑豆异黄酮提取率（Y）为响应值，得到各因子的二次回归拟合方程为：Y=0.65+0.070A+0.037B+6.167×10-3C+0.047D+0.044AB+0.030AC-0.022AD-0.018BC-0.061BD+0.069CD-0.089A2-0.086B2-0.13C2-0.023D2，方差分析结果见表3。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

由表3 可知，根据回归方差分析显著性检验，P＜0.000 1，说明回归模型方程达到极显著水平；失拟值P=0.217 47＞0.05，没有显著差异，说明回归方程与试验拟合良好；确定系数R2=0.952 0，调整系数R2Adj=0.972 5，说明模型方程与试验拟合程度好，试验误差小，可用此模型对黑豆异黄酮提取条件进行分析及预测。

回归方程各项方差分析表明，回归模型一次项A和 B 极显著（P＜0.01），D 显著（P＜0.05）；交互项 BD，CD为模型极显著因素（P＜0.01），其它交互项不显著；二次项 A2、B2和 C2为模型极显著因素（P＜0.01），其余各项对黑豆异黄酮得率影响均不明显。方差分析中，各因素对黑豆异黄酮得率影响的顺序为：离子液体浓度＞提取温度＞超声时间＞料液比。综上所述，该模型可用于分析和预测黑豆异黄酮的提取率，并确定最佳提取工艺条件。

2.2.3 响应面分析

采用Box-Behnken 软件对离子液体浓度、提取时间、液料比和提取温度之间两两交互作用的关系进行分析，结果如图5 所示。

图5 各因素交互作用的响应面图Fig.5 Response chart of the interaction of factors

由图5 可知，料液比与提取温度之间交互作用的响应曲面最陡峭，对响应值影响最显著；提取时间与提取温度之间交互作用的响应曲面相对陡峭，说明对响应值影响显著程度次之；提取时间与离子液体浓度、离子液体浓度与料液比、离子液体浓度与提取温度、提取时间与料液比的交互作用对提取率的影响显著程度逐渐减小，表现为曲线逐渐平滑，响应值无显著性变化。

2.2.4 验证试验

结合单因素试验，分析回归模型，经过验证，最终得出该提取方法准确可靠。黑豆异黄酮的最佳提取条件：离子液体浓度0.66 mol/L，提取时间49.05 min，料液比1 ∶21.71（g/mL），提取温度 60 ℃，理论预计值 0.692%。考虑到实际操作中的局限性，最终选择离子液体浓度0.65 mol/L，提取时间 49 min，料液比 1 ∶21（g/mL），提取温度60 ℃，进行5 次平行试验，得到异黄酮提取率的平均值为0.688 %，与预测值0.692 %接近，验证了此模型的有效性，说明预测模型与实际情况拟合较好。

2.3 抑菌活性研究

本试验测定了不同浓度黑豆异黄酮的抑菌活性，结果如表4 所示。

由表4 可知，异黄酮浓度低于0.25 mg/mL 时，对5种菌株的生长均无抑制作用；浓度在0.5mg/mL～1.75 mg/mL 对金黄色葡萄球菌的生长有较明显的抑制作用；浓度在0.75 mg/mL～1.75 mg/mL 对短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的生长有较明显的抑制作用。在一定浓度范围内，异黄酮的抑菌作用随着浓度的升高而增强。

表4 异黄酮抑菌能力测定Table 4 Bacteriostasis of Isoflavones

3 结论

本研究采用离子液体-超声辅助提取法，对黑豆异黄酮的提取工艺进行了研究，得到最佳工艺条件为：离子液体浓度 0.65 mol/L、料液比 1 ∶21（g/mL）、提取温度60 ℃、提取时间49 min，此条件下黑豆异黄酮的提取率可达0.688%，较文献报道的提取率0.221%～0.488%有较大提高。采用滤纸片法确定黑豆异黄酮的抑菌活性，除大肠杆菌和酵母菌无抑菌活性，对其他菌株均表现出抑菌活性。

采用离子液体超声辅助提取黑豆中异黄酮，可对中药中的复杂成分选择性提取，与传统提取工艺相比，所需溶剂少，离子液体可重复利用，是一种高效提取黑豆异黄酮的方法。食品中添加的化学防腐剂在人体蓄积可致癌，滥用抗菌药物使得菌株的抗菌能力越来越强，后续可对其抑菌机制等进行研究，更好地为天然抗菌抑菌剂的研发提供理论依据。