超声辅助糖基化改性玉米醇溶蛋白结构和机械性能的影响

郭浩，张慧君，陈又铭，李萍，王一正

（齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江省果蔬杂粮饮品工程技术研究中心，黑龙江齐齐哈尔161006）

有些天然植物蛋白因其特殊的氨基酸组成，通常被认为不完全蛋白，且不能满足食品体系或者加工的需求，因此需要对这类蛋白质进行改性。蛋白质改性的实质是切断蛋白质分子中肽链上的基团，再经过聚合反应或引入新的基团来进行修饰，使其分子结构发生特定的结构变化，从而造成蛋白空间结构和理化性质改变，使蛋白功能特性得到改善[1]。

玉米醇溶蛋白（zein）是玉米湿法加工淀粉副产物——玉米黄粉中的主要蛋白质，它含有较多的非极性氨基酸和较少的极性氨基酸，这些氨基酸分子间在二硫键、疏水键和氢键的作用下连接在一起，具有良好的成膜特性[2]。然而由纯玉米醇溶蛋白制成的膜材质较脆，机械性能差，限制了在食品及其它领域的应用。

加入塑化剂是一种提高膜机械性能的蛋白质化学改性的常用方法[3-5]，但是存在如改性操作条件苛刻，化学试剂残留、形成有毒的氨基酸衍生物和改变营养价值等弊端[6-8]。糖基化改性是食品加工和保藏的一种常见方法，是将蛋白质分子中氨基酸侧链的自由氨基与糖分子还原末端的羰基之间的羧氨反应[9]，主要有干热法和湿热法两种方式[10-14]。其中干法就是利用蛋白质和多糖发生美拉德反应，通过调节反应时间和温度等条件，使糖基化反应控制在初级阶段，褐变程度低。干热法虽然较湿热法反应时间长，条件苛刻，但是可使蛋白质的氨基保持非聚集状态，且反应温度低于蛋白质的变性温度，反应生成物功能性好，而且由于多糖仅有一个还原末端，与蛋白质反应也比较简单。

由于玉米醇溶蛋白不溶于水，易溶于60%～95%的乙醇溶液中，而多糖在乙醇溶液中形成沉淀，因此在干法糖基化反应时，氨基供体和羰基供体不能很好相容。利用超声可以解决还原多糖在玉米醇溶蛋白的醇溶液中的分散性。另外当超声作用于介质中，会发生周期性压缩和扩张作用的疏密振动波，在不断变换压缩和扩张的过程中，超声波就会产生近于真空或含少量气体的空穴（气泡）。空穴经多次周期振荡最终迅速破裂，同时产生高强度的剪切力打断蛋白质肽链之间的化学键，破坏了蛋白分子间或分子内化学键间的紧密联系，使蛋白质内的氨基酸基团暴露，进而使糖基化反应的化学位点暴露出来，提高糖基化反应程度[15-16]。另一方面，玉米醇溶蛋白中二级结构是氨基酸残基在肽链中通过二硫键、疏水键和氢键连接在一起的构象，包含α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲。随着超声功率的增加使超声波逐渐产生强烈的剪切作用和空化效应，并转化为机械能、热能，破坏蛋白质肽链上的肽键，促进糖基化改性反应，提高改性后产物的机械性能[17-20]。

近年来，超声波技术对蛋白质改性方面研究越来越吸引学者的关注。朱建华[21]研究了超声波处理对大豆分离蛋白溶解性的影响，结果表明大豆分离蛋白溶液经不同功率的超声处理后溶解度随超声功率的增大而增大。王喜波等[22]采用超声技术辅助琥珀酰化改性大豆蛋白，测得改性产物乳化活性和乳化稳定性分别比未改性样品提高了94.5%和268.9%。赵璞等[23]利用超声波技术对牛乳中含量最多的酪蛋白进行改性，测定其功能特性，结果表明随着超声处理中时间和功率的增加，酪蛋白功能性质中溶解性、乳化性以及乳化稳定性都有不同程度的提高。

本研究采用菊粉（inulin）作为还原糖的供体，它是由果糖分子通过β（2-1）键连接，末端含有一个葡萄糖分子的高分子化合物，是聚合度DP ＞10 以上，纯度为95%的多聚果糖。考察玉米醇溶蛋白在超声辅助改性过程中玉米醇溶蛋白的结构变化，探索其与提高膜机械性能的作用之间的关系，为玉米醇溶蛋白的糖基化改性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米黄粉：黑龙江省镜泊湖农业开发股份有限公司；菊粉：大连佐源生物工程科技有限公司；邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）：天津光复精细化工研究所；Tris、甘氨酸：生物生工（上海）工程股份有限公司；5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸 （5，5-Dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、盐酸胍、尿素：上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醇、巯基乙醇、无水乙醇（分析纯）：天津市天大化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

超声波信号发生器（WSL-1000D）：南京顺流仪器有限公司（变幅杆为Φ6）；真空冷冻干燥机（LYOQUEST-85）：西班牙泰士达公司；超低温冰箱（Thermo702）：赛默飞世尔科技有限公司；万能材料试验机：山东济南普创机电有限公司；圆二色谱仪（Jasco-815）：日本分光（JASCO 公司）；纳米粒度 Zeta 电位分析仪（Zetasizer Nano zs90）：英国马尔文仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

取适量玉米黄粉，经酶法除淀粉、脱色后的样品，用70%（体积分数）浓度乙醇溶液浸提2 h，5 000 r/min离心15 min，取上清液，用冰水浸提，调pH6 左右，离心后得到沉淀，水洗，冷冻干燥，得到玉米醇溶蛋白样品，备用。

1.3.2 糖基化改性及膜的制备

用70%的乙醇溶液溶解玉米醇溶蛋白，配制8%的蛋白溶液，按一定物料比加入菊粉，搅拌溶解后，调pH 值，以不同功率对溶液进行超声处理，冻干后粉粹，放入温度60 ℃，湿度为79%的密闭干燥器中进行糖基化反应，反应后立即冷却，置于30 ℃的烘箱中烘干剩余水分，得到改性后的糖基化产物（zein-inulin）样品。

将改性后的产物用70%乙醇溶解后，倒入模具于70 ℃烘箱烘干成膜。将烘干后的膜于温度30 ℃、相对湿度43%干燥器内平衡48 h，备用。

1.3.3 巯基和二硫键含量的测定

采用 Ellman’s 试剂比色法[25]测定。5，5’-二硫基双-2-硝基苯甲酸在pH8.0 时与巯基相互作，生成硫代硝基苯阴离子，硫代硝基苯阴离子在412 nm 处的摩尔吸光系数ε=13 600，吸光值与巯基的数量成正比[26]。具体步骤如下：

取75 mg 样品用1 mL Tris-甘氨酸缓冲液混匀后加4.79 g 盐酸胍，用缓冲液定容至10 mL。

测定巯基时，取1 mL 该液加4 mL 脲-盐酸胍溶液和0.05 mL Ellman's 试剂，于412 nm 处测吸光值。

测定二硫键时，取1 mL 溶液，加0.05 mLβ-巯基乙醇和4 mL 脲-盐酸胍溶液，于25 ℃保温1 h，然后加入10 mL 12%三氯乙酸，继续于25 ℃恒温1 h，经5 000 r/min 离心10 min 后，用5 mL 12%三氯乙酸清洗沉淀物2 次，将沉淀物溶于10 mL 8 mol/L 脲中，加0.04 mL Ellman’s 试剂，测取 412 nm 处的吸光值。

计算如下式：

式中：μ巯基代表巯基含量；A412为 412 nm 处的吸光值；D 为稀释因子（巯基取5.02，巯基+还原的二硫键取10）：C 为样品浓度，mg/mL。

式中：μ二硫键代表二硫键含量；N1为还原前的巯基数；N2为还原后的巯基数。

1.3.4 接枝度的测定

采用邻苯二甲醛（OPA）法[24]测定。

按照文献配制试剂，测定时，移取4 mLOPA 试剂于试管中混匀，加入蛋白浓度为10 mg/mL 样品液200 μL，再次混匀后于 35 ℃水浴反应 2 min，在 340 nm下测其吸光值。OPA 溶液中加入200 μL 赖氨酸代替样品液为空白。二者之差为游离氨基的净吸光值并作出赖氨酸的标准曲线为y=1.914x-0.001，r2=0.999 0，根据净吸光值计算样品中游离氨基的含量。接枝度按照下式计算：

式中：C0为未改性前溶液中游离氨基的含量，mol/L；C1为改性后溶液中游离氨基的含量，mol/L。

1.3.5 蛋白膜抗拉强度测定

将膜剪成15 mm×85 mm 的矩形长条，置于万能材料试验机上，固定好，夹距设定为45 mm，拉伸速度为100 mm/min。计算如下式：

式中：TS 为抗拉强度，MPa；F 为最大拉力，N；L 为膜样品的厚度，mm（采用测厚仪对样品膜的4 个边缘处和中心处分别重复3 次，求平均值为该膜厚度）；W为膜样品的宽度，mm。

1.3.6 粒径的测定

将玉米醇溶蛋白与其改性产物用70%乙醇溶液充分溶解后，经不同的超声功率处理后，用纳米粒度Zeta 电位分析仪将样品依次进行测定。

1.3.7 圆二色谱的测定

样品溶液的配制：准确称取一定量玉米醇溶蛋白与改性产物，用70%乙醇溶液配成浓度为0.02 mg/mL的蛋白样品溶液，样品进行0.22 μm 有机相膜过滤后，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

远紫外区的CD 谱测定：将样品注入光径10 mm的石英样品池，采用Jasco-815 圆二色谱仪对样品在198 nm～260 nm 进行扫描，扫描速率为 100 nm/min，响应时间0.5 s，谱带宽度1.0 nm，灵敏度为20 mdeg，与室温下重复扫描样品8 次，记录CD 谱，求平均值作为最终光谱值。得到蛋白质的平均摩尔椭圆吸收率用[θ]（deg cm2/dmol）表示，根据Chen-Yang 原理和最小二乘法编写的程序计算出蛋白质的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的百分含量。

1.4 数据处理方法

2 结果与讨论

2.1 超声功率对接枝度的影响

接枝度表示在糖基化反应中，蛋白质与糖发生接枝反应的程度，本研究比较了经不同超声功率预处理后的接枝度，结果如图1 所示。

图1 接枝度变化图Fig.1 Grafting degree change diagram

由图1 可知，超声功率的变化会影响玉米醇溶蛋白与菊粉之间糖基化反应接枝度的大小。随着超声功率的增大，糖基化改性产物的接枝度有逐渐增大的趋势。当超声功率在400 W 时，接枝度达到最大值，为31.25%，随后继续提高超声功率至500 W，其接枝度反而开始下降至28.65%。说明当超声功率增大时，在溶液中形成更高频率的振荡，蛋白质分子的空间结构被破坏，致使肽键断裂，导致N-末端游离残基数目过度增多，自由氨基也过度增多，菊粉中的还原糖与赖氨酸的碰撞几率变小，导致了糖基化改性的接枝度下降[27]。

2.2 不同超声功率对巯基和二硫键的影响

蛋白质是由α-氨基酸通过肽键连接而成的具有四级空间结构的复杂高分子化合物。超声处理在一定程度上使蛋白质内不同的氨基酸基团暴露，使得与这些基团紧密相关的结构特性也发生相应的改变。不同超声功率对巯基和二硫键的影响见表1。

表1 超声功率对蛋白巯基和二硫键含量的影响Table 1 Effect of ultrasonic power on sulfydryl group and disulfide bond of zein

由表1 可知，纯玉米醇溶蛋白中原始自由巯基含量为 6.7 μmol/L pro，二硫键含量为 18.55 μmol/L pro。在糖基化改性过程中，随着超声功率的逐渐增加，超声过程中产生的空穴效应和机械作用对蛋白质的作用位点产生剪切力，将蛋白质上的肽链打断，破坏其一级结构和二级结构，蛋白分子内部残基受到破坏使其暴露于蛋白分子表面，部分还原成巯基[18]。另一方面，超声波处理使蛋白结构得到伸展，原本包埋在蛋白质分子内部的巯基逐渐暴露出来，使糖基化改性产物的自由巯基含量逐渐上升，二硫键的含量逐渐下降[28]。另外在前期研究中也发现[27]，当超声功率超过最适值后，继续提高超声功率，会使改性后的蛋白成膜效果也下降，这可能是因为蛋白膜具有良好的成膜性是与氨基酸分子中的二硫键含量有关，因此随着超声功率的增加，二硫键呈减少趋势，不利于成膜，因此在最适超声功率条件下，适量减少蛋白质的二硫键含量，可增加蛋白膜的柔韧性。

2.3 超声功率对玉米醇溶蛋白膜机械性能的影响

本研究考察不同超声功率对玉米醇溶蛋白-菊粉膜抗拉强度、伸长率的影响，结果如图2 所示。

图2 超声功率对抗拉强度与伸长率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on tensile strength and elongation of zein

蛋白质的结构特性是决定其膜机械性能的基础。蛋白质空间结构的改变会在一定程度上引起蛋白膜机械性能的变化。在糖基化改性过程中，蛋白质与菊粉发生糖基化反应，使改性后玉米醇溶蛋白的空间结构也发生变化，即蛋白质分子发生一定程度的伸展，促使蛋白分子成膜时疏水基团和巯基交联而富有柔韧性，增加膜的机械性能[29]。表征膜机械强度的指标通常采用抗拉强度和断裂伸长率。图2 结果表明，超声波功率变化对玉米醇溶蛋白-菊粉膜的机械强度同样产生影响。随着超声功率的逐渐增大，玉米醇溶蛋白-菊粉膜的抗张强度和伸长率都呈现出先升高后降低的趋势。当超声功率为500 W 时，蛋白膜的抗张强度和伸长率均达到最高值。说明此时对玉米醇溶蛋白进行糖基化改性后的蛋白膜的机械性能较好。但当超声功率大于500 W 时，蛋白膜的机械强度反而下降，说明功率过高并不利于蛋白膜的机械性能的提高，这与文献一致[30]。本文重点考察超声对蛋白膜机械强度的提高，因此选择500 W 的超声功率。

2.4 粒径分析

本研究对不同超声功率预处理后糖基化改性的蛋白产物进行粒径检测，结果如表2 所示。表中蛋白质分散系数（polymer dispersity index，PDI）为代表溶液的分散程度，PDI 值越小，代表溶液的分散性越好[32]；而粒径大小直接影响后期蛋白成膜的机械性能，分子粒径越大，蛋白膜的成膜性越好，抗拉强度越大。

表2 超声功率对玉米醇溶蛋白-菊粉粒径分布的影响Table 2 Effect of ultrasonic power on size distribution of zeininulin

随着超声功率的增加，粒径大小有逐渐升高的趋势，但当超声功率达到550 W 时，粒径急剧减小，这可能是由于超声功率过大会导致蛋白分子内部细胞破碎，粒径减小。超声功率在350 W 时，溶液的分散性较好，但其粒径大小为1 458 nm，相比超声功率为500 W时的粒径大小2 113 nm 小得多。本文主要研究蛋白质的成膜性，即机械性能，所以综合以上分析，认为超声功率为500 W 时粒径最大，溶液分布较均匀，结合图2中超声功率对抗拉强度的影响，认为在该条件下制得的蛋白膜机械性能较好。

2.5 圆二色谱分析

通过蛋白质的圆二色谱图（circular dichroism，CD）的远紫外区谱带位置和吸收强弱的分析，可确定蛋白质和肽二级结构。本研究以超声条件为500 W 的玉米醇溶蛋白-菊粉与玉米醇溶蛋白，进行比较，考察超声后的糖基化产物二级结构的变化，结果如图3 和表3所示。

图3 圆二色谱图Fig.3 Circular dichroism spectra

表3 玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-菊粉的二级结构组成Table 3 Secondary structure content of zein and zein-inulin g/100 g 氨基酸

由图3 分析可知，玉米醇溶蛋白的远紫外区CD光谱的肽键吸收峰在207 nm 附近有一较强的负峰，在224 nm 有一很强的负峰，此处为α-螺旋结构特征峰，在218 nm 附近有一负峰，此处为β-折叠结构特征峰，与报道的α-zein 中Z19 蛋白CD 特征峰相似[32]。一般而言，当蛋白质二级结构被完全破坏时，而吸收峰会发生红移或蓝移现象。由图3 可知，糖基化反应后，接枝产物在207 nm 处的负峰强度有降低趋势，224 nm处的负峰有蓝移现象，218 nm 负峰有红移现象。结果表明经菊粉改性后的玉米醇溶蛋白改变了蛋白质的二级结构，破坏了原玉米醇溶蛋白中的二硫键。

Frank A.等[33]用CD 测定玉米醇溶蛋白在50 %～80 %乙醇溶液中的二级结构研究发现α-螺旋结构的含量在33%～60%之间，且α-螺旋和β-折叠含量接近。由表3 可知，本研究中玉米醇溶蛋白的圆二色谱远紫外图谱中，其二级结构的主要结构以α-螺旋结构为主，约占50%，这与该文献中玉米醇溶蛋白的α-螺旋含量相符，除此之外还含有β-折叠和无规则卷曲，各自约占25%左右，其中α-螺旋结构含量是β-折叠的2 倍左右，有研究认为这与玉米醇溶蛋白提取条件有关[34]。

蛋白质中多肽链的α-螺旋结构由分子间氢键作用形成的，经超声辅助改性后α-螺旋含量降低，β-折叠含量增加，无规则卷曲含量略有升高，仍没有β-转角结构。说明超声辅助糖基化改性后，一方面氢键受到破坏，α-螺旋发生一定的解链，结构变得更加松散[35]。另一方面，与菊粉中的还原羰基反应的ε-氨基位于α-螺旋结构中，因此，ε-氨基与多糖的结合是造成α-螺旋结构的减少主要原因[36]。另外蛋白质的折叠结构发生了去折叠，更多的糖越容易接入蛋白质肽链中，后期在超声的机械作用和热效应下又进行了再折叠，β-折叠含量增加了11.3%，因此超声辅助糖基化改性使得玉米醇溶蛋白二级结构发生变化，分子由有序变得无序。这样，玉米醇溶蛋白-菊粉分子脆性结构减弱，韧性结构增加，提高了机械性能。

3 结论

本研究以玉米醇溶蛋白为氨基供体，利用超声波技术辅助菊粉糖基化改性，得出如下结论。

1）超声波处理可以促进玉米醇溶蛋白糖基化反应，尤其在适当功率下超声使蛋白结构得以伸展，蛋白中自由氨基含量增加，使接枝反应中蛋白氨基和糖类羧基交联机遇增大，促进了接枝反应的发生，从而使玉米醇溶蛋白得到适度的糖基化改性，修饰蛋白结构。

2）超声波作用增加了糖基化改性蛋白质的自由巯基的含量，促进了在成膜形成过程中二硫键的形成。说明超声作用后玉米醇溶蛋白自由巯基的含量增加，使其在成膜过程中二硫键生成量增加，由于膜的形成是蛋白通过疏水基团以及二硫键形成分子量更大的聚集体，聚集体产生内聚性的力打破维系天然蛋白分子间的作用力促使蛋白分子发生重排，形成新的相互作用力以支撑新的蛋白结构使膜结构发生变化，降低膜的脆性，增强膜的韧性，从而提高膜的机械性能。