云芝浸膏对小鼠CCl4肝损伤保护作用机制研究

冯耀培，宋娟，郑斯文，曲正义，姚丽娜，王英平

（中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）

病毒性肝炎发病率在当今社会日趋增加，逐渐成为影响人们生活的元凶。CCl4肝损伤模型作为经典模型，研究较为广泛。CCl4进入机体后，在肝细胞色素P450 影响下，被代谢产生氯仿自由基（CCl3·），引起肝组织细胞脂质过氧化，并对细胞膜和细胞器造成损伤[1]，其损伤特点与人类病毒性肝炎类似[2-3]。因此，建立CCl4肝损伤模型，开展对CCl4肝损伤保护作用研究具有重要意义。

云芝，多孔菌科真菌彩绒革盖菌〔Coriolus versicolor（L.ex Fr.）Quel〕的干燥子实体，是一种常用中药，收录于《中国药典》一部2015年版[4]，具有明显的消炎保肝、抗氧化等生物活性[5-7]，因此，云芝成为当下研究的热点。已有研究人员开展云芝多糖对免疫性、酒精性和乙酰氨基酚导致的肝损伤的保护作用研究[8-10]，取得较好疗效。本实验室前期开展云芝提取物对酒精肝损伤保护作用研究，初步得出CVE能缓解酒精造成的小鼠肝脏损伤，具有较好治疗效果。因此，基于CVE对酒精肝损伤具有良好保护作用，分别从肝脏病理、肝脏功能以及脂质过氧化等方面进行试验，开展CVE对小鼠 CCl4肝损伤的保护作用研究，并探讨其作用机制，为临床应用提供试验依据。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

ICR 小鼠，雄性，18.0～22.0 g，6 月龄。购于长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（吉）-2015-0001。

1.2 材料

云芝材料采自吉林省延边州汪清县林区，经吉林农业大学宋慧教授鉴定为多孔菌科彩绒革盖菌（C.versicolor Quel）的干燥子实体。

云芝浸膏（Coriolus versicolor extract,CVE）由本实验室提取完成，提取过程为将700.0 g 云芝清洗干净，加入12 倍量的蒸馏水，蒸煮3.0 h；第2 次再加入10 倍量蒸馏水，继续蒸煮3.0 h。所得浸膏即为试验所需药物，试验时，用生理盐水将其稀释为所需浓度。

1.3 试剂

谷丙转氨酶（ALT）试剂盒（批号：20180622）、谷草转氨酶（AST）试剂盒（批号：20180622）、总胆红素（TBIL）试剂盒（批号：20180622）、甘油三酯（TG）试剂盒（批号：20180622）、总胆固醇（TC）试剂盒（批号：20180622）、低密度脂蛋白（LDL-C）试剂盒（批号：20180622）、高密度脂蛋白（HDL-C）试剂盒（批号：20180622）、小鼠血清肿瘤坏死因子-酶联免疫（TNF-）试剂盒（批号：S20180819CW）、小鼠血清白介素-6酶联免疫（IL-6）试剂盒（批号：S20180819CW）、小鼠血清白介素-1 酶联免疫（IL-1 ）试剂盒（批号：S20180819CW）、丙二醛（MDA）试剂盒（批号：20180622）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：20180622）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（批号：20180622）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（批号：20180622），以上试剂均购于南京建成生物工程研究所；H ＆ E 染色试剂盒（批号：20170612，上海碧云天生物技术有限公司）；生理盐水（辽宁民康制药有限公司）；水飞蓟素（陕西森弗天然制品有限公司）；鲁花花生油（山东鲁花集团公司）；无水乙醇、甲醛、二甲苯、四氯化碳等均为国产分析纯。

1.4 仪器与设备

TGL-16 K 型离心机（湖南湘仪离心机厂）；HH-4型恒温水浴锅（常州澳华仪器公司）；FA 1004 B 型电子天平、YP 5002 型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；BioTek-Epoch 型酶标仪（美国BioTek 公司）；SK 5200 H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；LEICA EG 1150 H 型包埋机、LEICA RM 2255 型切片机（德国徕卡公司）；KD-T 型摊片机（浙江省科迪仪器设备有限公司）；Coyote-Bio G 200 型组织匀浆破碎仪（卡尤迪生物科技）；OLYMPUS BX 53 型光学显微镜〔奥林巴斯（中国）有限公司〕。

2 方法

2.1 分组

将试验小鼠适应性饲养5d，随机分6组，每组10只。分别为阴性对照组、模型组、水飞蓟素组（50.0mg/kg）及CVE 低（50.0 mg/kg）、中（100.0 mg/kg）、高（300.0 mg/kg）剂量组。

2.2 试验设计

保持动物饲养室温度为25±2 ℃，自由饮食。隔日称重，根据体重调整给药量，剂量为10 mL/（kg·d），周期30 d，末次给药后，禁食不禁水16 h。阴性对照组灌胃花生油，其余各组均灌胃1% CCl4花生油溶液建立肝损伤模型，剂量为5 mL/kg[11]，2 h 后解剖。摘眼球取血待测血清相关指标；脱颈处死，取肝左叶，固定，待做病理学研究，取肝右叶置于液氮内，待测肝组织相关指标。

2.3 指标测定

2.3.1 血清指标检测 摘眼球取血，4 ℃冰箱内静置2 h，后于冷冻离心机内，4 ℃，3 500 r/min 离心 10 min。取上清，以相同条件再次离心，分装，置于 80 ℃冰箱内待测血清 ALT、AST、TBIL、TC、TG、LDL-C、HDLC、TNF-、IL-6 和IL-1等生理生化指标。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

2.3.2 肝组织病理切片检查 取固定后的肝组织，切成规则方形小块（0.75 1.00 0.75 cm），置于包埋盒内。流水冲洗、脱水、浸蜡和包埋等步骤。切3m 厚度切片，摊片、烤片、H ＆ E 染色，置于光学显微镜下观察各组小鼠肝组织病理变化，并拍照。

2.3.3 肝组织匀浆指标检测 取保存于液氮内的肝组织样本，用生理盐水制作10%浓度匀浆，4℃，2500r/min离心10 min，取上清用于检测蛋白质含量、MDA、SOD、CAT 和GSH-Px 等相关指标。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

2.4 数据分析

3 结果

3.1 小鼠肝组织病理变化

图1 小鼠肝脏病理形态Fig.1 Liver pathomorphology in mice

由图1 H ＆ E 染色结果显示，阴性对照组肝细胞，圆润饱满、清晰可见，且细胞核呈规则圆形、胞质丰富，胞浆未见细胞破碎、坏死及炎性浸润等现象（图1A）。模型组小鼠肝组织细胞损伤严重，中央静脉周围可见大量细胞碎片状坏死及脂肪变性（图1B），表明CCl4肝损伤模型造模成功。阳性对照组小鼠肝组织细胞出现碎片状坏死及脂肪变性，但损伤程度得到明显的改善（图1C），显著低于模型组。CVE 各给药组小鼠肝组织细胞均出现碎片状坏死及脂肪变性现象（图1D、E、F），但损伤程度均低于模型组。结果表明，CVE 可以改善CCl4造成的肝脏脂肪变性及细胞碎片状坏死，且高剂量组效果最佳。

3.2 小鼠血清转氨酶相关指标

由表1 可得，与阴性对照组相比，模型组小鼠血清转氨酶ALT、AST活力均显著性升高（P＜0.05）；相较于模型组，CVE 各给药组均显著降低ALT、AST 活力（P＜0.05），且呈现剂量依赖性，同时高剂量组效果强于阳性对照组。

表1 小鼠血清AST、ALT 活力Table 1 Serum AST and ALT activities in mice （±s,n=10）

表1 小鼠血清AST、ALT 活力Table 1 Serum AST and ALT activities in mice （±s,n=10）

注：与阴性对照组比：#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；与模型组对比：*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。下表同。Note:Compared with the normal group: #P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01;Compared with the model group: *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01.The follwing table is the same.

组别 Groups剂量〔mg/（kg·d）〕 Dosage ALT 活力（U/L） levels of ALTAST 活力（U/L） levels of AST阴性对照组 Negative control group 50.11±29.59 47.44±13.99模型组 Model group 290.53±1.02## 215.25±22.00##阳性对照组 Positive control group 50 284.21±4.83** 194.14±15.43*CVE 低剂量组 CVE low-dose group 50 283.70±4.85** 181.74±14.09**CVE 中剂量组 CVE middle-dose group 100 279.12±2.00** 166.25±24.4**CVE 高剂量组 CVE high-dose group 300 277.60±7.14** 180.45±15.62**

3.3 小鼠血清脂肪相关指标

由表2 可得，与阴性对照组相比，模型组小鼠血清TBIL、TG、TC、LDL-C 含量显著升高，且HDL-C 含量显著降低（P ＜0.05）。阳性对照组TBIL、TG、TC、LDL-C 含量均低于模型组，且TBIL、TC 的含量显著降低（P ＜ 0.05），HDL-C 含量显著升高（P ＜ 0.05）。CVE各浓度组TBIL、TG、TC、LDL-C含量与模型组相比，显著降低（P ＜ 0.05）；HDL-C 含量升高，但仅有高剂量组HDL-C 含量的显著增高（P ＜0.05）。总体而言，小鼠血清各项指标CVE 高剂量组效果最佳。

表2 小鼠血清 TBIL、TG、TC、LDL-C、HDL-C 含量Table 2 Serum TBIL,TG,TC,LDL-C and HDL-C content in mice （±s,n=10）

表2 小鼠血清 TBIL、TG、TC、LDL-C、HDL-C 含量Table 2 Serum TBIL,TG,TC,LDL-C and HDL-C content in mice （±s,n=10）

组别Groups剂量〔mg/（kg·d）〕Dosage TBIL（ mol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）阴性对照组 Negative control group 1.11±0.68 2.44±0.46 4.60±0.44 0.45±0.11 2.44±1.07模型组 Model group 10.50±2.59## 3.05±0.72# 7.15±0.68## 0.80±0.14## 1.48±0.54#阳性对照组 Positive control group 50 5.64±1.57** 2.56±0.30 4.17±0.96** 0.65±0.17 1.94±0.24*CVE 低剂量组 CVE low-dose group 50 6.49±2.17** 1.83±0.39** 3.78±0.57** 0.38±0.05** 1.67±0.61 CVE 中剂量组 CVE middle-dose group 100 7.34±1.71* 1.51±0.34** 3.44±0.96** 0.36±0.13** 1.88±0.53 CVE 高剂量组 CVE high-dose group 300 4.96±2.18** 1.29±0.30** 2.85±0.78** 0.33±0.11** 2.05±0.25*

3.4 小鼠血清炎性因子相关指标

表3 小鼠血清 TNF- 、IL-6、IL-1 含量Table 3 Serum TNF- ,IL-6 and IL-1 content in mice （±s,n=10）

表3 小鼠血清 TNF- 、IL-6、IL-1 含量Table 3 Serum TNF- ,IL-6 and IL-1 content in mice （±s,n=10）

组别 Groups剂量〔mg/（kg·d）〕 DosageTNF-（ng/L）IL-6（ng/L）IL-1（ng/L）阴性对照组 Negative control group 112.67±12.47 27.85±8.32 21.38±4.58模型组 Model group176.67±49.66## 45.32±12.01## 49.26±9.84##阳性对照组 Positive control group 50 155.82±18.35 36.55±8.93 33.29±7.80**CVE 低剂量组 CVE low-dose group 50 169.25±27.81 39.04±10.14 38.36±6.78*CVE 中剂量组 CVE middle-dose group 100 172.61±19.17 33.53±9.20* 37.44±6.25*CVE 高剂量组 CVE high-dose group 300 130.58±31.98* 28.37±11.15** 29.06±4.29**

3.5 小鼠肝组织氧化还原相关指标

由表4 可得，与阴性对照组相比，模型组小鼠肝组织 SOD、CAT 及 GSH-Px 活力降低，除 GSH-Px 活力外其余差异均显著（P＜0.05）；MDA含量显著升高（P＜0.01）。阳性对照组SOD、GSH-Px 及CAT 活力均高于模型组，除GSH-Px 活力外其余差异均显著（P ＜0.05）；MDA 含量低于模型组。CVE 各组 SOD、CAT及 GSH-Px 活力均高于模型组（P ＜ 0.01）；MDA 含量均低于模型组，且高剂量组各项指标均差异显著（P＜0.05）。试验结果表明，小鼠肝组织匀浆各项指标CVE高剂量组效果最佳。

表4 小鼠肝组织SOD、GSH-Px、CAT 活力及MDA 含量Table 4 The levels of SOD,CAT,GSH-Px activities and MDA content in liver tissues in mice （±s,n=10）

表4 小鼠肝组织SOD、GSH-Px、CAT 活力及MDA 含量Table 4 The levels of SOD,CAT,GSH-Px activities and MDA content in liver tissues in mice （±s,n=10）

组别 Groups剂量〔mg/（kg·d）〕Dosage SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mgprot）CAT（U/mgprot）MDA（nmol/mgprot）阴性对照组 Negative control group 40.15±1.01 4.60±2.13 161.33±86.95 9.60±5.86模型组 Model group 30.11±3.02## 3.30±0.66 84.14±42.12# 19.51±5.57##阳性对照组 Positive control group 50 40.14±2.02* 3.88±1.84 137.50±54.15* 15.89±3.96 CVE 低剂量组 CVE low-dose group 50 45.17±4.13** 3.79±0.34* 100.63±17.47 13.57±9.80 CVE 中剂量组 CVE middle-dose group 100 46.13±3.02** 3.53±0.54 103.57±57.84 13.46±6.71*CVE 高剂量组 CVE high-dose group 300 48.16±4.01** 4.24±0.99* 139.58±35.36** 13.35±1.80**

4 讨论与结论

通过观察肝组织病理切片可得模型组肝细胞出现大量溶解、脱落现象，而研究结果表明，CVE 能改善CCl4造成的肝细胞脱落、溶解，以及脂肪变性，这与孙卉等[12]开展的云芝多糖保肝效果所得结论一致。在前期开展云芝提取物对小鼠酒精肝损伤的保护作用研究中发现CVE能明显改善肝功能及病理病变，这与本研究结果一致。

血清ALT和AST活性是评估肝损伤最常用指标。在体内，肝细胞内的ALT 和AST 活力远远大于血液。在正常状态下，肝细胞内的转氨酶会通过较高的浓度差进入到血液中去[13]。而当肝细胞出现轻微的损伤时，细胞出现裂解，大量的ALT 和AST 等转氨酶就会游离出来，导致肝脏细胞外及血清中转氨酶活力急剧增大，血清转氨酶活力升高程度可反映出肝细胞的受损程度[14-16]。本研究发现CVE 对小鼠血清转氨酶ALT 和AST 活力升高具有良好的抑制作用。这与沈钦海等[17]开展的云芝保肝作用研究结论一致。且高剂量组效果最佳，强于水飞蓟素。

机体肝脏受损时，体内会产生较多自由基，当自由基含量超过人体承受范围时，就会引起“氧中毒”，TBIL、TG、TC和LDL-C等含量会发生过度积累，进而导致血脂代谢发生紊乱。研究发现，当机体内TG 含量升高时，常常伴随着HDL-C 的降低，从而降低运输胆固醇到肝脏中的能力，导致肝脏损伤[18]。TG 在肝细胞内大量积累，进而造成脂肪病变，迫使肝脏转变为储脂器官，最终导致脂肪肝形成[19-20]。本研究测得CVE 可显著降低小鼠血清内积累的TBIL、TG、TC 和LDL-C 含量，并可使HDL-C 含量升高，且高剂量组效果最佳。

已有研究证明，肝病患者具有较高的促炎细胞因子[21]。TNF-、IL-1和IL-6 等诱导枯否氏细胞分泌和外周血单核细胞分泌，是重要的炎症因子指标[22]。在本研究中，CCl4肝损伤小鼠血清中TNF-、IL-1和IL-6 水平明显增加，这表明CCl4引发促炎细胞因子释放，而预给药CVE 可以有效降低肝炎症因子浓度。这与刘颖[23]开展蒸制桔梗对酒精肝损伤的保护作用结果一致。

机体存在SOD、CAT、GSH-Px 等组成的酶反应体系，可有效清除机体产生的自由基。当自由基的产生超过自身防御系统的清除能力时，就会发生氧化损伤，最直接伤害部位为肝脏[24]。当机体发生脂质过氧化时，会产生MDA。MDA 不仅能够反应肝细胞脂质过氧化的强弱，还可间接反应自由基对肝细胞的损伤程度[25]。本研究中发现CVE 能明显升高SOD、CAT 和GSH-Px 等抗氧化酶活力，并且降低肝组织中MDA 含量，从而达到对肝脏的保护作用。这与孙设宗、Ravan等[26-28]研究结果一致。试验结果显示，高剂量组效果最佳。

综上所述，CVE 高剂量组保肝效果最佳，且强于水飞蓟素。其保肝机制可能与抑制氧化应激、改善相关酶类及细胞因子有关，这对云芝的临床应用提供了试验依据。