CPV-2c型犬细小病毒分离及其VP2序列分析

施鹏飞，程悦宁，冯二凯，罗国良，王振军，易立

（中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）

犬细小病毒病（Canine parvovirus disease）是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染所引起的一种急性、高度接触性传染病，以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征，主要感染幼犬消化道[1]。美国科学家Eugstet等1977年首次通过电镜在患病犬腹泻物中发现CPV 颗粒[2]。我国于1982年由军事医学科学院军事兽医研究所首次分离出CPV。目前，CPV 在我国东北、华北、华中等地区广泛流行[3-4]。CPV 基因组全长约5 300 bp，其中包含2 个开放阅读框，分别编码结构蛋白（VP1 和 VP2）和非结构蛋白（NS1 和 NS2），其中衣壳蛋白VP2 主要影响CPV 的抗原性和宿主范围[5]。根据 CPV 中 VP2 基因出现的氨基酸替换，分为CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，New CPV-2a、New CPV-2b等基因型。目前，CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，New CPV-2a、New CPV-2b 等新基因型已经取代了CPV-2，在世界范围内广泛传播[6-8]。2014年，我国分离和鉴定出CPV-2c 病毒，同时发现该病毒已经发生新的突变，证实了CPV 在我国继续发展[9]。本研究从疑似CPV 感染的犬粪便病料中分离出了CPV，并且对其VP2 序列进行基因推导氨基酸分析，然后进行进化树分析，旨在丰富新型CPV-2c 变异体的遗传数据，为后续流行病学研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 毒株及细胞株

F81 细胞、犬细小病毒阳性毒株、CPV鉴定引物均保存于中国农业科学院特产研究所特种动物病原与免疫实验室。

1.2 主要试剂与仪器

1.3 病料来源及处理

粪便样品采集于武汉宠物医院的患病犬只，主要临床症状为腹泻、精神抑郁等。取采集的粪便样品0.6 g置于1.5 mL EP管中，用PBS按1∶8 的比例进行稀释混匀，于4 ℃下12 000 r/min 离心3 min；取上清液经0.22m滤膜过滤，将处理后的上清液样本置于 80 ℃下保存备用。最后取出部分病料溶解液，使用犬瘟热、犬细小、犬冠状病毒试纸条进行鉴定。

1.4 病毒分离

1.5 VP2全基因扩增及序列分析

根据NCBI 网站上已发表的CPV-2 株（GenBank登录号为M38245）基因序列，设计扩增VP2 基因全长的引物，引物序列 VP2-F 为 5'-ATGAGTGATGGAGCAGTTC-3',VP2-R 引物序列为 5'-AATATAATTTTCTAGGTGCTAG-3'，预期扩增片段大小为1 750 bp。PCR 条件为 95 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，共 30 个循环。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，条带大小正确后，胶回收连接pMD-18T 载体，转化DH5感受态大肠杆菌，挑取阳性菌落提取质粒，并送交吉林省库美生物科技有限公司测序，查找GenBank上已发表的国内外不同基因型的CPV毒株VP2 基因序列，使用MEGA 7.0 软件进行基因序列及氨基酸序列同源性分析，并绘制进化树。使用DNAMAN 软件对序列数据进行转换、分析和比较。进化树的绘制使用MEGA 7.0 软件，系统种系发生树的构建基于Neighbor-joining 程序，验证采用Bootstrap=500 trails。本研究选取18 株犬细小病毒参考毒株进行了分析。

2 结果与分析

2.1 病毒分离

经试纸条鉴定可知，犬细小病毒试纸条检测结果为阳性，犬瘟热和犬冠状病毒试纸条检测结果皆为阴性。2c-I 样品接种单层培养的F81 细胞，并观察细胞病变。从图1 可以看出，2c-I 样品接毒后48～72 h 细胞出现拉网、脱落典型的细胞病变，少部分细胞死亡聚集在一起。对照组细胞正常；接毒组细胞连续盲传3代，观察到比较稳定的细胞病变现象，证明成功分离到1 株病毒，暂命名为 2c-I。

图1 接毒后细胞病变Fig.1 Cytopathic effect after intoxication

2.2 VP2基因扩增结果

用VP2 全基因引物对CPV分离株2c-I的VP2 基因进行PCR 扩增，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在1 750 bp左右出现目的条带，与预期结果相符(图2)。将 PCR 产物回收并克隆到 pMD18-T 载体（TaKaRa 公司）上，具体步骤均参照试剂盒说明书操作。连接成功后，DH5感受态细胞转化，挑取单克隆菌落至试管中培养，经菌液PCR 鉴定阳性的，再提取质粒进行测序。

2.3 测序结果分析

将此次分离的1 株犬细小病毒和来自 GenBank数据库中具有地域代表性的10 株 CPV 毒株 VP2 基因所推导的氨基酸序列，采用Clustal W方法进行相互比对，结果见表1。由表1 可知，本研究中的2c-I 株犬细小病毒流行株属于CPV-2c亚型（Glu426），2c-I毒株序列呈现独特的变异：Phe267 至Tyr267 出现变异。VP2 测序结果已经上传至 NCBI 网站，登录号为MN686018。

图2 CPV 分离株VP2 基因扩增结果Fig.2 The amplification result of VP2 gene from CPV isolated strain

表1 CPV VP2 基因推导氨基酸分析Table 1 The deduced amino acid analysis of VP2 gene of CPV

2.4 系统进化树分析

利用MEGA7.0 软件，对2c-I 株犬细小病毒以及GenBank 数据库中6 株国内和15 株国外细小病毒参考毒株的VP2 蛋白氨基酸序列建立了系统进化树（图3）。从图3 可以看出，CPV分离株2c-I与国内的LZ-2、HRB-A6、SH1516 等同属于CPV-2c 亚型。本研究建立的进化树在选取CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c在内的多株细小病毒的基础上，重点选取6 株国内2016—2018年分离的CPV-2c 亚型毒株，并重点分析了CPV-2c 亚型在国内的遗传变异情况。从拓扑分类上，CPV 分离株2c-I 与所选的6 株国内毒株同源性都很接近，但又不在同一分支上，结合其267 位氨基酸突变为酪氨酸（Tyr）情况来看，则暗示着在未来我国境内可能出现新的CPV-2c 亚型变异，需要重点监测。本研究中的CPV分离株2c-I 与2016年四川分离株CPV-2c 非常接近，同源率为99.8%。根据进化树分析可知，目前我国流行的犬细小毒株有 New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c，其中CPV-2b 和CPV-2c 主要在南方流行，而北方地区则较少。

图3 CPV VP2 核苷酸序列遗传进化树Fig.3 The nucleotide sequence genetic tree analysis of VP2 gene of CPV

3 讨论

犬细小病毒的主要宿主是幼犬，幼犬感染CPV后发病率高达90%，致死率为35%左右。不同生长期的幼犬感染犬细小病毒后出现不同的临床症状，子宫内胎儿或8 周龄以下幼犬感染多表现为心肌炎型，2～6 月龄幼犬感染多表现为肠炎型[10]。目前，世界范围内主要流行的毒株为CPV-2a 与CPV-2b 亚型，但在阿根廷等国家流行毒株则以CPV-2c 亚型为主[11]。据报道，我国目前流行的毒株主要为 CPV-2a 亚型，其次是CPV-2b亚型，2010年报道我国有CPV-2c亚型的发生，但未形成大规模流行[12]。本研究中的犬细小病毒为细小病毒 Type2c 亚型。从分离株（MN686018）VP2 基因推导的氨基酸序列显示，与我国境内流行的CPV-2c型相比，此次分离的细小病毒分离株虽然在分型的关键位点第426 位没有突变，但在第267 位点出现变异，推测其原因是由于265～267 位点并没有展示在细小病毒衣壳表面；同时，此次分离的细小病毒分离株与经典的CPV-2c型的VP2 氨基酸序列对比发现，2c-I的324位点突变为异亮氨酸（Ile）成为2C亚型中的新突变位点，这将对今后新亚型的出现产生一定的影响。值得注意的是，VP2 蛋白的324 位点氨基酸在蛋白和犬的转铁蛋白（Trf）结合中起重要作用，所以2c-I 毒株中VP2 蛋白的Trf结合能力是否随突变而改变需要进一步研究验证。324 位点的突变（Tyr→Ile）于 2004年在我国首次被发现，并在日本、韩国等亚洲地区都检测到该位点的突变[13]。以上2 个非关键位点的氨基酸变异对病毒的毒力、蛋白的表达以及宿主范围是否有直接的影响则有待进一步研究。依据本研究对犬细小病毒VP2 核苷酸序列进化树分析结果，此次分离的2c-I细小病毒野毒序列属于CPV-2c 亚型，与南美洲国家、意大利、美国的2c 亚型是有区别的，但与四川CPV08比较接近，据此推测，犬细小病毒的流行具有一定的地域性。由于新的突变位点的发现，所以应该加强对我国CPV-2c 亚型的监测，同时也要对可能出现的抗原表位改变和宿主范围扩增做出相应的预测。

本研究成功分离并鉴定出1 株CPV-2c，并进行了犬细小病毒2c型的分子流行病学调查，这不仅可为宠物疾病的防控提供有力依据，而且可以为特种经济动物养殖行业和野生动物保护奠定理论基础。