北极狐、貉、犬IFN-基因克隆及表达

李紫仟，廉士珍，胡博，张蕾，朱言柱，李滋睿，李伟，白雪，张海玲※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.吉林特研生物技术有限责任公司，吉林 长春 130112)

干扰素是在1957年英国科学家Isaacsz研究流感病毒干扰现象时首次发现的[1]，它是由动物细胞分泌的一种糖蛋白[2]。干扰素可以分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型[3]，其均对机体免疫应答有着增强作用，对病毒也有着广谱抗性作用[4]。干扰素属于Ⅰ型干扰素，在临床治疗病毒性疾病以及自身免疫疾病等多种疾病中起到重要作用[5]。1993年美国食品和药品管理局（FDA）组织批准干扰素- 在多发性硬化症治疗中的应用[6]。人IFN-也用于治疗慢性丙型肝炎[7]、乙型肝炎[8]。虽然干扰素- 具有广谱的抗病毒作用，但是其本身并不是一种抗病毒物质，而是通过诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白而发挥抗病的作用[9]。

随着基因克隆技术的不断突破，自1980年科学家成功克隆人成纤维细胞IFN（IFN-）后，猪、鸡、鹿等的IFN-基因也得到克隆，并对其活性进行了相关研究[10-12]。动物实验表明，重组鸡IFN-能减轻传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的法氏囊病变。而犬IFN-能够抑制犬细小病毒的复制[13]。犬、狐狸和貉属于同科不同属动物，不同动物同种干扰素活性有一定的差异。截至目前，与犬同科的毛皮动物狐狸和貉的干扰素-基因序列及抗病毒活性研究未见报道。本研究拟对北极狐（Alopex lagopus）、貉（Nyctereutes procyonoides）、犬（Canine）IFN-基因进行克隆、分析及表达，为开发犬、狐狸和貉通用型重组IFN-并将其应用于临床治疗提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 Escherichia coli JM109 感受态细胞由中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室保存。

1.1.2 试剂 pMD18-T 载体试剂、Ex Taq 聚合酶试剂、AMV 反转录酶及植物血凝素（PHA）试剂、DNA Marker 试剂、蛋白Marker 试剂〔宝生物工程（大连）有限公司〕；RPMI1640 试剂（美国Gibco 公司）；淋巴细胞分离液（中国医学科学院）；TRIzol细胞裂解液（美国Invitrogen公司）；胶回收试剂盒（杭州博日科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据 GenBank 上发表的犬IFN-cDNA 全序列（登录号为AF126247）设计扩增引物，扩增片段561 bp，引物序列如下：IFN-F 为5'-atgaccagta gatgcatc-3'；IFN-R 为 5'-tcagttctggagataatc-3'。

1.2.2 北极狐、貉、犬外周血淋巴细胞制备及干扰素诱生 选取健康的试验动物北极狐、貉、犬，在无菌条件下分别采取其外周抗凝血液5 mL，加入同等体积的RPMI 1640 培养液稀释。按照1∶1 体积比，将稀释的外周血缓慢加入淋巴细胞分离液上层，水平离心机2 000 r/min 离心40 min。用灭菌长针头将中间白色细胞层吸出，置于无菌离心管中，加RPMI 1640 培养基洗涤细胞，1 500 r/min 离心 10 min，洗涤 2 次后，用含25g/mL PHA和10%小牛血清的RPMI 1640 培养液重悬细胞，进行计数，按照计数结果将细胞悬液稀释至1 107个/mL，分别加入24 孔细胞培养板，将板置于CO2 培养箱中37 ℃培养24 h。

1.2.3 外周血淋巴细胞总RNA 的提取 收集诱导24 h后的淋巴细胞置于15 mL 离心管中，2 000 r/min 离心10 min，将沉淀物用1 mL TRIzol Reagent 重悬。加入1/5 TRIzol 体积氯仿，混匀后静置3 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上清，加入1/2 TRIzol 体积的异丙醇，混匀后放置 20℃沉淀1h，12000r/min离心15min，将沉淀物用75%乙醇重悬，并对其进行洗涤1 次，12000 r/min离心10 min，倒置控干后用9.5L 0.1%DEPC处理的灭菌水溶解沉淀物，即获得淋巴细胞总RNA。

1.2.5 表达载体构建 以测序正确的TA 克隆质粒为模板设计扩增IFN-成熟肽基因的引物，上游引物和下游引物分别引入酶切位点，将酶切后的PCR产物与pET28a 载体连接，转化到BL21 感受态菌，涂板，随机挑取多个单个克隆菌株进行鉴定。

1.2.6 阳性克隆菌株的诱导和鉴定 取测序鉴定阳性的重组菌液，按照1∶100 的比例接种于新鲜的LB（含100g/mL 氨苄青霉素）培养基中，放置于37 ℃恒温振荡培养箱培养至OD600达0.6～0.9，吸取1 mL 菌液作为对照，剩余菌液中加入IPTG，使IPTG 终浓度达1 mmol/L 继续培养3 h 以上。12 000 r/m 离心5 min收集菌体，加入原菌液1/10 体积PBS 重悬菌，12 000 r/min离心10 min，洗涤3 次后用200L PBS重悬后与等量2 SDS 上样缓冲液混匀，沸水煮沸5 min，以诱导前菌体和诱导空载体为对照，进行SDS-PAGE 电泳。

2 结果与分析

2.1 北极狐、貉、犬IFN-基因克隆

以PHA 诱导培养北极狐、貉、犬外周血淋巴细胞总RNA作为模板，经RT-PCR 分别获得北极狐、貉、犬IFN-基因。分别取RT-PCR 产物于1.5%（M/V）琼脂糖凝胶上电泳，结果显示，获得的PCR 扩增产物大小均为561 bp，与理论预测的值大小一致，结果见图1。重组质粒酶切鉴定及PCR 鉴定结果见图2、3。

图1 北极狐、貉、犬IFN- RT-PCR 扩增产物Fig.1 IFN- RT-PCR amplification product of arctic fox,raccoon dog,canine

图3 北极狐、貉、犬 -干扰素质粒PCR 鉴定Fig.3 PCR identification of arctic fox,raccoon dog and dog IFN- plasmids

2.2 IFN-基因序列分析

应用ExPASy-ProtParam tool 软件预测了北极狐、貉和犬的IFN-含有5 个位点一致的半胱氨酸残基位点，而水貂、雪貂和猫有4 个位点与其相同，这也可能造成IFN-构象的改变。预测狐和犬含有5 个潜在的N-糖基化位点，分别为46NGTT49、94NISI97、101NETT104、131NFTW134、136NRTL139，而貉只有 4 个潜在的糖基化位点且组成，与狐和犬的完全一致，而94DISI97位不是潜在的糖基化位点，结果见图5。糖基化位点的不同是否会引起貉与犬和狐的IFN-生物学功能差异有待进一步研究。

表1 貉、北极狐和犬IFN-基因核苷酸变异位点Table 1 Nucleotide mutation sites of raccoon dog,arctic fox and dog IFN- genes.

表1 貉、北极狐和犬IFN-基因核苷酸变异位点Table 1 Nucleotide mutation sites of raccoon dog,arctic fox and dog IFN- genes.

注：*为核苷酸同意义突变位点。Note:*Is nucleotide synonymous mutation site.

种类 Species 37 位* 90 位* 280 位* 282 位 340 位* 345 位 380 位 471 位* 500 位貉IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.png Raccoon dog IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngC A G C G A T A G北极狐IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngArctic fox IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngT G A T T G A G A犬IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngDog IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngT G A T T G A G A水貂IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngMink IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.png g A A T T G T G A雪貂IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngDomestic ferret IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.png g A A T T G T G A猫IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngCat IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.png g A A C C G T G A

图4 貉IFN-同意义突变位点Fig.4 Raccoon dog IFN- synonymous mutation site

图5 北极狐、貉、犬与水貂等动物IFN-干扰素氨基酸序列比较分析Fig.5 Comparative analysis of amino acid sequences of IFN- in arctic fox,raccoon dog,dog and mink etc animals

2.3 IFN-在大肠杆菌中的表达

将重组质粒 pET28-mRaIFN-阳性质粒转化至E.Coli BL21 感受态细胞，经 1 mmol/L IPTG 37 ℃诱导，变性胶SDS-PAGE电泳检测目的蛋白大小约为19kD，与预期大小一致，以包涵体形式表达，未诱导对照和空载体对照均未出现目的条带，以组氨酸单抗作为一抗Western blotting 进一步鉴定。从图6 可以看出，目的蛋白与单抗出现明显的沉淀线。

图6 北极狐、貉和犬IFN-SDS-PAGE 电泳检测Fig.6 Detection of SDS-PAGE electrophoresis in arctic fox,raccoon dog and dog IFN-

图7 His-单抗Western blot 检测貉和犬IFN-重组蛋白的表达Fig.7 Identification of recombinant protein by Western blotting with His-tag monoclonal antibody

3 讨论

本研究采用RT-PCR 技术从PHA 诱导的北极狐、貉、犬外周血淋巴细胞中扩增了IFN-基因，从序列分析比较结果得出，北极狐IFN-与犬IFN-基因同源性最高，达100%，而貉与犬和北极狐的IFN-差异明显，有9 个核苷酸的变异，其中有5 个同意义突变位点；预测的N-糖基化位点也有明显差异，这一结果也说明，北极狐和犬的IFN-基因进化关系更近一些，而貉较远。IFN-作为机体免疫中具有重要作用的细胞因子之一，也是机体免疫功能评判的重要指标之一，本研究构建了IFN-表达载体并成功表达了成熟肽蛋白，为开发IFN-兽用治疗制剂提供了理论基础。基因工程干扰素与其他型干扰素相比较，有着很多优点，例如污染小甚至没有污染、安全性高、成本低等[14]，从而使干扰素商品化，广泛应用于临床治疗与免疫，为新兽药的研发奠定基础。