4种调味料精油抗氧化及抑菌活性的评价

王丽霞，王 芳，刘孟宗，赵文华，王晨旭，陆艺菲

(天津科技大学新农村发展研究院，天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457)

植物精油是一种具有挥发性植物特有芳香味的油状液体，其主要来源于植物的花、叶、根、果实、种子等部位．陈建烟等[1]研究发现植物精油成分为萜类化合物、有机酸和微量元素等物质，尤其以单萜类和倍半萜类为主．目前提取植物精油的方法繁多，其中广泛使用的方法有传统的水蒸气蒸馏法和溶剂萃取法．传统方法设备简单、操作容易，但是蒸馏过程中物料长期处于高温状态，容易造成热敏性成分分解；溶剂萃取法获得精油容易将植物里的树脂等成分提取出来导致杂质较多[2]．超临界CO2萃取技术由于其萃取能力强、得率高、有效成分多、无溶剂残留等优点越来越受到人们的青睐，被广泛地应用于食品工业、医药品和保健食品领域[3]．

植物精油成分复杂而且本身含有多种生物活性，最突出的两个特性便是抗氧化活性和抑菌性．抗氧化活性对人体有重要作用，人类的糖尿病、心血管疾病、肿瘤等疾病都是由于体内自由基过多引起的．Daniel-Jambun等[4]用甲醇提取生姜中的酚类物质并测定了抗氧化能力，发现生姜具有较强的抗氧化活性，并且有效成分为非极性物质，亲脂性高更易通过细胞膜在细胞内部发挥作用．Wang等[5]研究了肉桂精油中的肉桂醛对牙龈卟啉菌生长有抑制作用，通过扫描电镜观察细胞膜破裂从而导致核酸和蛋白泄露，最终菌体死亡．本文比较生姜、大蒜、丁香、茴香这4种植物精油的抗氧化活性和抑菌活性，以期筛选出一种抑菌和抗氧化活性均较强的植物精油，作为食品添加剂用于食品行业，达到保鲜和抑菌等目的．

1 材料与方法

1.1 材料

选取黄爪姜块茎、蒲棵紫皮蒜鳞茎、紫丁香花蕾和小茴香果实经过超临界萃取获得植物精油(萃取条件为：萃取压力 35MPa，萃取温度 35℃，CO2流量15L/h，萃取时间 2h)．

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E. coli)、根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和青霉(Penicillium)由天津科技大学菌种保藏中心提供．

抗坏血酸(VC)、1，1–二苯基–2–三硝基苯肼(DPPH)、邻苯三酚、铁氰化钾、硫酸亚铁均为国产分析纯；营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基均为生化试剂．

SP–2102UV 型紫外–可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；DZF–6020型恒温培养箱，上海益恒科技有限公司；LS–B50LB50L型立式压力蒸气灭菌器，上海福玛实验有限公司；GCMS–QP2010Ultra型气相色谱质谱联用仪，美国瓦里安技术有限公司．

1.2 调味料精油的成分分析

参照白娟[6]气质条件，运用 GC-MS气质联用仪对 4种调味料精油进行定性、定量分析，通过质谱图库检索确定精油成分．

1.3 调味料精油抗氧化活性的测定

1.3.1 调味料精油对DPPH自由基(DPPH·)的清除

移取 2.0mL不同浓度的植物精油于具塞试管中，加入 2.0mL DPPH乙醇溶液(DPPH浓度为0.2mmol/L)，充分振荡混合均匀，放置具塞试管在黑暗中避光 30min，反应结束后使用酶标仪测量其在517nm处的吸光度．为消除试剂本身颜色对实验的影响，同时测定2.0mL DPPH乙醇溶液与2.0mL乙醇混合后的溶液的吸光度，以及同样反应体积的各种精油与 2.0mL无水乙醇混合后溶液的吸光度[7]．选用VC作阳性对照．DPPH·清除率按照式(1)计算．

式中：A0为无水乙醇与 DPPH混合溶液的吸光度；A为精油与 DPPH混合溶液的吸光度；A1为各浓度精油与乙醇混合溶液的吸光度．

心肌肌钙蛋白的分析问题:心肌损伤后cTn释放入血液循环需要一定时间，cTn水平到达峰值后逐渐下落。在症状发作初期，cTn检查结果与样本采集时间密切相关。因此，不能因cTn变化较小而判定为心肌梗死。同时，许多并发症也可导致患者基线cTn数值(特别是hs-cTn数值)上升，需引起注意。此外，围术期不同时间cTn的变化情况可用于鉴别急、慢性事件。

向试管中分别加入4.5mL pH 5.2的50mmol/L Tris-HCl缓冲液和1.0mL试样溶液，摇匀后25℃恒温水浴，同时将 3mmol/L邻苯三酚溶液(用10mmol/L HCl溶液配制)放在相同温度下预热，反应20min后立即加入0.3mL已经在水浴中经过加热的邻苯三酚溶液启动反应，反应 5min后加 4滴10mol/L HCl终止反应．测定其在 325nm处的吸光度．用 4.2mL的蒸馏水代替样品液作为空白管，以Tris-HCl缓冲液作空白调零，各浓度试样液用以各自反应管的调零[8]．选用VC作阳性对照．清除率按照式(2)计算．

式中：A0为空白对照的吸光度；A1为样品吸光度．

1.3.3 调味料精油对羟基自由基(·OH)的清除

在具塞比色管中分别加入 2.0mL FeSO4溶液(1mmol/L)、1.0mL H2O2溶液(2mmol/L)和 3.0mL(6.0mmol/L)水杨酸溶液，摇匀，37℃恒温水浴15min，测定反应后溶液在510nm下的吸光度．然后向试管中各自再加入 1.0mL不同浓度精油溶液，振荡混合均匀后，再次恒温水浴反应 15min，反应完成后，分别对各溶液在 510nm处的吸光度进行测定.空白管不加 H2O2溶液，用 2.0mL蒸馏水代替，按上述实验过程进行反应，测定最终反应液的吸光度[9].选用VC作阳性对照．·OH清除率按照式(3)计算．

式中：A0为未加入试样的吸光度；A1为加入试样的吸光度；A2为未加入H2O2的吸光度．

1.4 调味料精油抑菌活性的测定

1.4.1 抑菌圈直径

采用琼脂扩散法对调味料精油抑菌活性进行测定[10]．将已经活化好的菌种接种于液体培养基中，摇床培养使其数目级达到106～108，制备菌悬液以备后用．移取 100µL菌悬液于灭菌后的培养基表面，用无菌涂布棒涂布均匀，再将直径为6mm的滤纸片置于平板表面．移取20µL植物油于滤纸片上使其渗透均匀，加药后将平板置于相应温度的培养箱中培养．观察实验结果，测量抑菌圈直径并记录数据．

1.4.2 最小抑菌浓度与最小杀菌浓度

最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)采用二倍数稀释法进行测定．以 DMSO为溶剂，配制不同质量浓度的植物精油，在无菌试管中加入 10mL灭菌的液体培养基、100μL菌悬液、0.1mL植物精油，在最适宜的培养条件下培养 36h，以不浑浊试管的最小试样浓度为最小抑菌浓度(MIC)．将试管混合液移取 100μL均匀涂布于平板上，培养 24h后，观察菌落生长情况，以无菌生长情况为最小杀菌浓度(MBC)．

1.5 数据处理

所有实验均进行3次重复实验，采用SPSS 13.0软件进行数据分析，结果以“平均值±标准差”表示.

2 结果与讨论

2.1 调味料精油成分分析

对生姜精油、大蒜精油、丁香精油和茴香精油的成分进行了分析，文中共截取了 25种主要成分，结果见表1—表4．由表1可知生姜精油挥发性成分主要是一些单萜和倍半萜类物质，其中相对含量最高的成分是姜烯，含量为 19.57%；其次为α–姜黄烯，含量为 7.51%；姜酮和 6–姜酚分别为 5.51%和 2.91%.Mesomo等[11]使用超临界萃取的生姜精油主要成分为α–姜烯、β–倍半水芹烯、α–姜黄烯、α–金合欢烯、β–甜没药烯和香茅醛．

表1 生姜精油成分分析Tab. 1 Major chemical composition of ginger essential oil

通过分析发现大蒜挥发油成分主要是含硫化合物和成环烯烷类．二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚和二烯丙基四硫醚都是大蒜精油主要成分．

对丁香挥发油成分分析发现：其挥发油组分主要为倍半萜烯和酚类物质，其中主要成分丁香酚相对含量为 85.82%；α和 β 葎两种类型的 草烯含量都较高，分别为 2.17%、8.74%．González-Rivera等[12]分析了水蒸气蒸馏获得的丁香油成分，其中丁香酚含量为66.90%，石竹烯含量为 24.80%，葎草烯和乙酸丁香酚酯含量分别为3.10%和2.70%．

表2 大蒜精油成分分析Tab. 2 Major chemical composition of garlic essential oil

表3 丁香精油成分分析Tab. 3 Major chemical composition of clove essential oil

对超临界萃取的茴香油运用气质联用仪对其成分进行研究发现：茴香油主要成分为茴香脑(81.17%)、对烯丙基茴香醚(4.59%)、小茴香酮(1.49%)和柠檬烯(1.13%)．Díaz-Maroto 等[13]研究由同步蒸馏和超临界萃取两种方法获得的茴香精油成分一致，主要成分为反式茴香脑、对烯丙基茴香醚和茴香酮．但是两者的相对含量仍有较大差别．

表4 茴香精油成分分析Tab. 4 Major chemical composition of fennel essential oil

4种精油成分复杂，但共有一些相同成分，如蒎烯、榄香烯、石竹烯、松油醇等化合物．α–蒎烯在生姜精油和茴香精油中的含量分别为 0.82%和0.50%．生姜精油和茴香精油中都检测出松油醇，其中生姜精油是α–松油醇，含量为 0.24%；茴香精油中的是 β–松油醇，含量为 0.10%．榄香烯在生姜精油、丁香精油和茴香精油中含量分别为 1.33%、0.01%和0.10%．

2.2 调味料精油对DPPH·的清除活性

4种调味料精油对 DPPH·的清除活性如图 1所示．由图 1可知：在实验浓度范围内，调味料精油清除 DPPH·能力随着质量浓度的增加而增加，当质量浓度达到200μg/mL时，丁香精油和茴香精油清除率分别为 62.72%、53.85%；当质量浓度继续增加到250μg/mL时，生姜、大蒜、丁香、茴香精油对DPPH·的清除率分别为 60.43%、30.77%、74.26%、67.95%．当VC质量浓度为 150μg/mL时，清除率已超过 80%，说明其具有良好的抗氧化能力．当质量浓度达到 200μg/mL时丁香精油、茴香精油、生姜精油和VC对DPPH·清除率相差不大．4种植物精油均对DPPH·有不同程度的清除能力，综合来看精油清除能力从大到小依次为丁香精油、茴香精油、生姜精油、大蒜精油．实验结果中丁香精油对 DPPH·清除能力最强，实验结果与刘万臣[14]的研究结果一致，其原因是采用超临界萃取获得的丁香精油中含有大量的丁香酚，酚类物质具有较强的抗氧化活性，故而丁香精油本身清除DPPH·能力较强．

图1 不同调味料精油对DPPH·的清除活性Fig. 1 Activity of DPPH· scavenging of different essen-tial oils

2.3 调味料精油对的清除活性

图2 不同调味料精油对的清除活性Fig. 2 Superoxide anion radical scavenging of different essential oils

2.4 调味料精油对·OH的清除活性

4种调味料精油对·OH的清除活性如图 3所示．由图 3可知：4种调味料精油对·OH均具有较强的清除能力并且清除能力随着质量浓度的增加而逐渐增加．当精油质量浓度为 50μg/mL时，生姜、大蒜、丁香、茴香精油清除·OH 的清除率依次为13.66%、3.55%、23.57%、6.72%．当质量浓度为200μg/mL时，丁香对·OH 清除率达到 53.41%，生姜精油对其清除率为 34.83%，大蒜精油和茴香精油清除率分别为 22.84%和 27.53%．观察 VC对·OH清除能力，除了质量浓度为 50μg/mL清除率仅为 12.77%低于生姜精油和丁香精油的清除率，其余质量浓度指标均高于实验组．4种调味料超临界精油对·OH清除能力从大到小依次为丁香、生姜、茴香、大蒜. Fujisawa等[15]发现丁香精油中的丁香酚物质在抗氧化方面发挥了重要作用，主要由于丁香酚中不饱和双键能够贡献酚氢原子，从而具有抗氧化活性．Mi等[16]说明生姜精油能够作为自由基清除剂应用于食品工业中，主要缘于生姜中的酚类物质如姜酚、姜烯酚等能够给电子或氢原子，并且能够捕捉自由基，从而终止过氧化链反应机制．

图3 不同调味料精油对·OH的清除活性Fig. 3 Hydroxyl free radical scavenging of different essential oils

2.5 调味料精油的抑菌活性

采用琼脂扩散法研究调味料精油对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E. coli)、根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和青霉(Penicillium)的抑菌活性．以抑菌圈直径、MIC、MBC指标评定调味料精油对测试菌种的抑菌作用，结果见表5—表7．

表5 调味料精油的抑菌圈直径Tab. 5 Inhibition zone diameters of essential oils

从表 5可以看出：调味料精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、根霉、黑曲霉和青霉都有不同程度的抑制作用．其中，大蒜精油对青霉抑制作用最强抑菌圈直径为(29.25±0.17)mm，其次为根霉和黑曲霉．茴香精油对青霉的抑制效果最好，在测试浓度中青霉被完全抑制生长，其对金黄色葡萄球菌的抑制作用最不明显，抑菌圈直径为(9.05±0.13)mm．然而生姜精油对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，其抑菌圈直径达(27.35±0.17)mm，对霉菌抑制作用比对细菌抑制作用较弱，抑菌圈直径小于 16mm．根霉对丁香精油比较敏感，其抑菌圈直径为(27.30±0.07)mm．每种精油对细菌和真菌抑制作用不同，大蒜精油及茴香精油对真菌的抑制作用大于对细菌抑制作用，细菌对生姜精油和丁香精油更为敏感．抑菌实验中精油对实验菌种抑菌圈直径均大于 9mm，所以调味料精油对测试菌种均表现出较强的抑制作用．

表6 调味料精油的最小抑菌浓度Tab. 6 MIC of essential oils µg/mL

表7 调味料精油的最小杀菌浓度Tab. 7 MBC of essential oils µg/mL

从表6和表7中发现：精油品种不同对不同菌种的最小杀菌浓度和最小抑菌浓度也有所不同．金黄色葡萄球菌对生姜精油最为敏感，最小抑菌浓度为15.25μg/mL；生姜精油对金黄色葡萄球菌抑制作用最好，最小杀菌质量浓度为 40μg/mL．在测试菌种中，丁香对大肠杆菌的抑制作用最强，最小抑菌质量浓度为 16.75μg/mL，最小杀菌质量浓度为40μg/mL．MIC和MBC数据与抑菌圈直径数据趋势一致，说明所选精油的抑菌活性较好，有潜力作为食品防腐剂应用于食品工业中．精油能渗透进细胞结构的磷脂双分子层，通过作用于微生物的细胞膜结构，从而使细胞膜形态发生改变，如出现褶皱、凹陷、破裂等现象，破碎的细胞膜使其渗透性发生改变，导致细胞内溶物流出，最终致使菌体死亡[17-19]．

3 结 语