GAP1基因缺失对上面发酵酵母高级醇代谢能力的影响

孙中贯，王孟祺，王亚平，肖冬光

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

小麦啤酒是以小麦芽作为主要原料，有时也使用未发芽的小麦作为原料生产的一类啤酒[1]．根据我国2008年颁布的GB/T 4927—2008[2]规定：小麦芽应占麦芽使用总量的 40%以上，而德国啤酒《纯净法》规定小麦芽用量占总原料的50%以上[3]；目前在国际上并未形成统一的规定．小麦啤酒采用上面发酵法酿制，发酵温度一般为 20～24℃[4]，成品小麦啤酒具有泡沫洁白细腻、口味醇厚、苦味较轻、热量高、营养丰富等特点[5-6]．

20世纪80年代，我国啤酒企业就已经开始引进小麦啤酒，但多年来小麦啤酒在消费者中的认知度并不高．近年来，随着消费者的需求日趋多元化、细分化、个性化，同时由于全球大麦资源的短缺、价格的上涨；各地啤酒企业积极调整产品结构，开发高品质、多元化、个性化的产品[7]．其中，小麦芽以其优良的酿造特性而受到酿造者们的青睐[8-9]．但小麦啤酒由于其较高的发酵温度以及原料中丰富的蛋白质含量，导致成品中高级醇含量高达300mg/L以上，而大麦啤酒的高级醇含量一般在 100mg/L以下，优质啤酒则需控制在 50mg/L左右[10-11]．高级醇含量过高，将导致饮用后产生口渴、头痛等症状，不利于饮用者的身体健康，严重影响小麦啤酒的发展[12]．

高级醇是在啤酒酿造过程中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)产生的主要风味代谢产物之一；其合成过程主要有两条途径：一种是以丙酮酸为代谢起始物的糖酵解合成代谢途径；另一种是以氨基酸为代谢起始物的氨基酸分解代谢途径，如图1所示[10-13]．目前，有关高级醇的代谢研究主要集中在这两条途径上[11]，而有关酵母菌株碳、氮源代谢调控对高级醇代谢影响的研究还鲜有报道．

在酿酒酵母中，GAP1基因编码的氨基酸转运蛋白是一种通用型的氨基酸运输载体，能够将培养物中所有的在蛋白质中常见的D型和L型氨基酸转运到酵母细胞内，供酵母生长代谢所用[14-15]．Chiva等[16]研究发现，GAP1基因的缺失不仅会影响酿酒酵母对氮源的利用，还对其他氨基酸转运蛋白的表达产生了影响．GAP1基因对酿酒酵母氨基酸的利用具有十分重要的作用，这有可能影响酿酒酵母合成高级醇的代谢能力，但目前还没有研究报道GAP1基因与高级醇代谢之间的关系．

本研究以上面发酵酵母 S17为出发菌株，通过构建GAP1一个等位基因敲除菌株和GAP1两个等位基因敲除菌株，考察GAP1基因缺失对酿酒酵母高级醇代谢能力及发酵性能的影响．

图1 酿酒酵母高级醇代谢网络图Fig. 1 Biosynthetic pathways of higher alcohols formation in Saccharomyces cerevisiae

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及引物

本研究中所用菌株见表 1，引物见表 2．质粒pUG6(Kanr，包含loxP-KanMX-loxP)为本实验室保存．其中，上面发酵酵母S17购于中国工业微生物菌种保藏中心(保藏号为CICC1929)．

表1 菌株Tab. 1 Strains

表2 引物Tab. 2 Primers

1.1.2 主要仪器

MS204S电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；PCR仪、核酸分析仪，美国Bio-Rad公司；全自动生长曲线分析仪，芬兰 Bioscreen公司；1100系列高效液相色谱仪、7890A型气相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；实时荧光定量PCR仪，美国AB公司．

1.1.3 培养基

酵母培养基(YEPD，g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨20，酵母浸粉10，自然pH．

细菌培养基(LB，g/L)：胰蛋白胨10，氯化钠10，酵母浸粉5，自然pH．

半乳糖诱导培养基(YEPG，g/L)：半乳糖 20，蛋白胨20，酵母浸粉10，自然pH．

麦芽汁培养基：称量粉碎后的小麦芽，按 1﹕4的料水比，30℃投料并保持 30min，65℃保持90min，78℃保持 10min，经过滤、煮沸、冷却至室温后，调整表观糖度至12°P．

以上培养基的固体培养基需加20g/L琼脂粉．

1.2 实验方法

1.2.1 目的片段的扩增

以上面发酵酵母 S17菌株的基因组 DNA为模板，利用引物对 GA-F/GA-R、DGA-F/DGA-R、GBF/GB-R、DGB-F/DGB-R扩增GAP1基因的两条上游同源序列 GA和 DGA、两条下游同源序列 GB和DGB．以质粒 pUG6为模板，GK-F/GK-R、DGKF/DGK-R为引物扩增KanMX、KanMX-D片段．

1.2.2 酵母的转化和重组子的筛选

酿酒酵母的转化采用 LiAc/SSDNA/PEG法[17].利用G418筛选转化子，提取转化子基因组进行PCR定点验证．

1.2.3 啤酒发酵实验

将甘油管中保存菌种转接至 YEPD试管斜面30℃活化培养 2d．取活化后的斜面菌种 1环，接种于装有50mL 12°P麦芽汁培养基的250mL三角瓶内，24℃静置培养 36h．种子液经离心无菌水洗涤2次后得到酵母泥，按 0.5%的接种量接入盛有150mL麦芽汁培养基的 250mL三角瓶内，20℃静置发酵．

1.2.4KanMX抗性基因的去除

采用 Cre/loxP报告基因挽救系统[18]，剔除阳性转化子中的筛选标记基因KanMX．利用影印平板法筛选 G418抗性阴性转化子，以 K-U/K-D为引物对进行PCR验证．

1.2.5 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

酵母RNA的提取使用Yeast RNAiso Kit酵母总RNA提取试剂盒(TaKaRa公司)，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa公司)进行基因组 DNA的去除和 cDNA的合成．使用SYBR®PremixEx TaqTMⅡ 试剂盒(TaKaRa公司)进行实时荧光定量 PCR，通过 ΔΔC(t)值法对目的基因及内参基因UBC6进行基因表达量的分析．

1.2.6 指标测定

生长曲线的测定：以 YEPD液体培养基为空白对照，采用全自动生长曲线测定仪测定菌液在波长为600nm处的吸光度．以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生长曲线．

CO2排放量的测定：发酵前预先称量发酵体系总质量，发酵过程中每隔12h称量1次，称量前应先摇晃三角瓶，以去除发酵液中的 CO2，当质量减少小于0.1g时，表示发酵已经结束[19]．

糖类物质的测定：葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖含量测定采用高效液相色谱法[19]．高效液相色谱条件为：Bio-Rad公司的 Aminex HPX-87H色谱柱(300mm×7.8mm，9μm)，流动相为 5mmol/L 的稀硫酸，流量 0.6mL/min，柱温 65℃，检测器为示差折光检测器，检测器温度 45℃．样品稀释到合适的质量浓度(低于 1000mg/L)并用 0.22μm 的滤膜过滤，进样量20μL．

α–氨基氮含量的测定：采用茚三酮比色法测定．2mL样品稀释液中加入 1mL显色剂，沸水浴中加热 16min，立即在 20℃水浴中冷却 20min，于570nm测定吸光度．

啤酒中高级醇含量的测定：啤酒发酵液经蒸馏后得到的样品使用气相色谱法测定．色谱条件：LAP-930色谱柱(50m×0.32mm×1.0μm)；检测器为氢火焰离子化检测器；初始柱温 50℃，保持 8min，以5℃/min的升温速率升至200℃，保持5min；进样量1.0μL；分流比 10﹕1．

其他发酵参数的测定：利用手持糖度折光仪测定原麦汁的表观糖度；利用斐林试剂法测定发酵液中还原糖的含量；酒精度及发酵度的测定依据啤酒分析方法进行[20]．

2 结果与讨论

2.1 GAP1一个等位基因敲除重组菌株的构建

将GAP1基因上游同源序列GA片段、下游同源序列 GB片段和KanMX片段转化上面发酵酵母S17，同源重组过程如图2所示．对在G418质量浓度为50mg/L的YEPD平板上生长的转化子进行PCR验证，获得的阳性转化子命名为S17G．

重组菌株 S17G的 PCR验证结果如图 3所示．以重组菌株 S17G基因组为模板，以 G1-F/G1-R为引物能够扩增得到长度为 1304bp的片段，以G2-F/G2-R为引物能够扩增得到长度为1012bp的片段，两条片段均与设计片段长度一致；而以出发菌株 S17基因组为模板无法获得与目的片段长度一致的条带，同时也没有扩增得到其他长度的片段．PCR验证结果证实，KanMX片段已整合到出发菌株 S17的基因组上，且整合位点正确．

构建GAP1两个等位基因敲除的重组菌株，需要以重组菌株 S17G为模板，并再次利用KanMX抗性基因作为筛选标记，因而必须剔除存在于重组菌株S17G基因组上的KanMX抗性基因．利用 Cre/loxP报告基因挽救系统可以实现KanMX抗性标记的剔除和反复利用．

图2 同源重组过程Fig. 2 Homologous recombining process

图3 重组菌株S17G的PCR验证Fig. 3 PCR verification of the mutant strain S17G

重组菌株S17G基因组中的KanMX抗性基因剔除的 PCR验证结果如图3(b)所示，将获得的阳性转化子命名为S17G-K．以K-U与K-D为引物，以重组菌株 S17G为模板，能够扩增出长度为 1613bp的KanMX抗性基因片段；以重组菌株S17G-K为模板，无法扩增出与KanMX抗性基因长度一致的目的片段；结果证实重组菌株 S17G基因组中的KanMX抗性基因已被剔除．

重组菌株 S17G-K敲除GAP1一个等位基因的PCR验证如图 3(c)所示．以出发菌株 S17的基因组为模板，利用引物DG1-F/DG2-R能够扩增得到1条长度为2148bp的片段，片段长度与设计片段长度大小一致．以重组菌株 S17G-K的基因组为模板，能够扩增得到 2条长度分别为 2148bp和 755bp的片段，且片段长度与设计片段长度大小一致．PCR验证结果表明重组菌株 S17G-K为GAP1一个等位基因敲除的重组菌株．

2.2 GAP1两个等位基因敲除重组菌株的构建

采用缩进式基因整合的方式，即同源序列 DGA位于同源序列GA的下游区域，同源序列DGB位于同源序列GB的上游区域，且同源序列彼此之间均无重复区域，将上游同源序列 DGA片段、下游同源序列DGB片段和KanMX-D片段转化重组菌株S17GK，同源重组过程参照图2．获得的G418抗性转化子经PCR验证，结果如图4所示．

以重组菌株 S17G-K为出发菌株，再次进行GAP1基因的敲除，将得到的阳性重组菌株命名为S17G2．以重组菌株 S17G2基因组为模板，利用两对引物 DG1-F/DG1-R、DG2-F/DG2-R能够扩增获得长度分别为1394bp和1033bp的片段，且片段长度与设计片段长度一致．而以出发菌株S17G-K的基因组为对照，无法扩增获得与目的片段长度一致的片段，同时也没有扩增得到其他长度的片段．PCR验证结果证实，重组片段已整合到出发菌株S17G-K的基因组上，且整合位点正确．重组菌株 S17G2剔除KanMX抗性基因的重组菌株S17G2-K的PCR验证如图4(b)所示．以K-U与K-D为引物，以重组菌株S17G2为模板，能够扩增获得长度为 1613bp的KanMX抗性基因片段；以重组菌株 S17G2-K为模板，无法扩增得到与KanMX抗性基因长度一致的目的片段；结果证实重组菌株 S17G2基因组中的KanMX抗性基因已被剔除．

以重组菌株 S17G2-K的基因组为模板，利用引物 DG1-F/DG2-R能够扩增得到长度分别为 1705bp和 755bp的片段，所得片段长度与设计片段长度大小一致，PCR验证结果表明获得的重组菌株 S17G2-K为GAP1两个等位基因敲除的突变株．

图4 重组菌株S17G2的PCR 验证Fig. 4 PCR verification of the mutant strain S17G2

2.3 GAP1基因转录水平

为了检测GAP1基因在重组菌株中的表达量，利用实时荧光定量 PCR技术，以 GAP1-F与 GAP1-R为引物，对重组菌 S17G、S17G2及亲本菌株 S17的GAP1基因转录水平进行测定，结果如图 5所示.

图5 GAP1基因转录水平Fig. 5 Transcription of GAP1 gene

GAP1一个等位基因敲除后，其转录水平约降低了 65%，GAP1两个等位基因敲除后，其转录水平为0；实验结果表明，GAP1基因的敲除降低了其在酿酒酵母菌株S17中的表达水平．

2.4 重组菌株生长性能分析

以原始菌株S17为对照，对敲除GAP1一个等位基因的重组菌株 S17G和敲除GAP1两个等位基因的重组菌株S17G2进行生长曲线的测定，结果如图6所示．重组菌株的生长速率均受到了一定程度的影响．与原始菌株相比，重组菌株 S17G的生物量没有发现显著的变化；而重组菌株 S17G2的生物量受到了一定程度的影响，较原始菌株稍有下降．这可能是由于GAP1基因部分或完全敲除后菌株对氨基酸的吸收能力受到了影响，从而阻碍了菌体的生长．

图6 重组菌株S17G、S17G2及亲本S17的生长曲线Fig. 6 Growth curves of mutants S17G，S17G2 and parental strain S17

2.5 重组菌株发酵性能分析

对重组菌株及亲本菌株进行全小麦麦芽汁发酵，每隔12h称量1次，测定发酵液的CO2释放量，结果如图 7所示．重组菌株 S17G、S17G2与亲本菌株S17相比，在整个发酵过程中重组菌株S17G的CO2释放量较亲本菌株 S17略低，重组菌株 S17G2的CO2释放量最低；但重组菌株S17G及S17G2的整体发酵趋势与亲本菌株S17一致，说明GAP1基因的敲除没有显著影响菌株的发酵速率．

图7 重组菌株S17G、S17G2及亲本S17的CO2释放量Fig. 7 CO2 emission amount of mutants S17G，S17G2 and parental strain S17

发酵结束后，测定各菌株发酵液中还原糖含量、酒精度及发酵度，进一步探究重组菌株的基本发酵性能，结果见表3．对表中数据进行t检验，结果表明重组菌与亲本菌株 S17 发酵液的酒精度、还原糖含量以及发酵度均无明显差异，说明GAP1基因的敲除没有影响啤酒发酵的基础指标．

2.6 不同菌株风味物质的代谢能力

重组菌株与亲本菌株代谢产生高级醇和酯类物质的差异，见表 4．与出发菌株 S17相比，重组菌株S17G 发酵产生的总高级醇含量降低了 17.47%，其中异丁醇的生成量下降最为显著，降低了46.01%，另外，在酯类物质中乙酸异戊酯的生成量降低了52.61%；重组菌株 S17G2 发酵产生的总高级醇含量进一步降低，降低了21.98%，其中除异丁醇的生成量下降最为显著外，活性戊醇、正丙醇、异戊醇也有不同程度的降低，在酯类物质中，乙酸异戊酯的生成量降低了约 45.76%．这表明GAP1基因对酿酒酵母高级醇代谢具有极为显著的影响．

表4 不同菌株风味物质代谢能力的比较Tab. 4 Comparison of flavor substance produced by different strains

2.7 α-氨基氮及糖类物质的代谢能力

利用茚三酮比色法测定发酵过程中重组菌株与亲本菌株发酵液中α–氨基氮的含量，其变化趋势如图8所示．与亲本菌株S17相比，重组菌株S17G和S17G2对α–氨基氮的利用能力明显减弱，不仅利用速率出现不同程度的减缓，发酵结束后发酵液中α–氨基氮的含量也显著增加．结果证明，GAP1基因的部分或完全缺失都会对上面发酵酵母 S17利用α–氨基氮的能力产生影响，但影响程度并没有随基因功能的减弱呈叠加效应．

图8 不同菌株发酵过程中α-氨基氮的含量Fig. 8 Concentration of α-amino acid of different strains during fermentation

通过 HPLC 测定了发酵结束后，各菌株发酵液中麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖的含量，结果见表5．

表5 不同菌株糖类物质代谢能力的比较Tab. 5 Comparison of metabolic capacity of carbohydrates different strains

重组菌株 S17G、S17G2 和亲本菌株 S17 均能够充分利用全小麦麦芽汁中的葡萄糖和麦芽三糖；但对麦芽糖的利用，重组菌株与亲本菌株相比存在显著差异．发酵结束后，重组菌株 S17G 的麦芽糖利用能力降低31.08%，重组菌株S17G2 的麦芽糖利用能力降低35.14%．这些实验结果表明，GAP1基因的部分或完全缺失对上面发酵酵母 S17利用麦芽糖的能力产生了一定影响．

重组菌株S17G与S17G2对α–氨基氮和麦芽糖的利用能力均呈现下降的趋势，对重组菌株的发酵性能和生长性能产生了一定的影响，同时影响了重组菌株合成高级醇及酯类物质等次级代谢产物的能力.这可能是因为重组菌株对碳源和氮源利用能力的下降不足以对菌株的初级产物合成能力产生显著的影响，而只是显著影响了次级代谢产物的合成能力．

3 结 论

本实验利用基因同源重组的原理及 Cre/loxP报告基因挽救系统，在上面发酵酵母菌株中实现了GAP1基因的单敲除和双敲除．重组菌株 S17G及S17G2的高级醇合成能力得到不同程度的减弱．通用型氨基酸通透酶编码基因GAP1的部分或完全缺失能够减弱酿酒酵母对α–氨基氮的利用能力，同时对麦芽糖的利用能力产生一定程度的影响．发酵性能的测定结果表明，重组菌株符合啤酒发酵的基本要求，具有一定的实际应用潜力．