PD-L1表达抑制剂的筛选及其抗肿瘤活性

景 磊，赵苗苗，姜 博，李玉银，刁爱坡

(天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

肿瘤细胞可以利用免疫检验点(immune checkpoint)调节 T淋巴细胞的功能[1]，从而逃逸免疫系统对肿瘤细胞的识别与杀伤作用．机体免疫细胞的激活与抑制是通过共刺激信号进行调节，其中程序性死亡蛋白 1(PD-1)与其配体蛋白 PD-L1作为一个主要的免疫检验点，是一个负调节性信号途径．当 PD-1/PD-L1信号激活后，抑制T淋巴细胞的活化和细胞因子的分泌，使机体免疫应答受到抑制[2–3]．因此，阻断PD-1/PD-L1信号的传递是激活机体抗肿瘤免疫应答的有效途径[4]．

目前，靶向 PD-1/PD-L1免疫检验点的抗体类阻断剂已经在超过 1000例临床试验中被评估并取得了一定的疗效[5]，但是，大约 1/3的患者在治疗过程中会出现乏力、头昏、全身肌肉酸痛等现象，部分患者甚至会出现严重的免疫相关不良反应[6–8]．与抗体类阻断剂相比，小分子多肽类药物则没有抗体的局限性，如减弱 Fc–免疫效应功能，同时可以避免与免疫相关的不良反应[9]．目前已有许多非抗体类 PD-1/PD-L1信号通路抑制剂被报道，如 PD-1蛋白表面肽段的突变体和 D–型短肽等[10-11]，但是需要进一步的临床评估．小分子化合物具有高稳定性、易穿透性、低成本性和方便口服的特性，具有广阔的发展空间，由于 PD-1/PD-L1相互作用结构区域具有高度疏水的特性，致使靶向于该位点的小分子化合物阻断剂的发展远远滞后于抗体阻断剂的发展．目前只有百时美施贵宝公司设计开发的一类小分子化合物可以直接作用于PD-1/PD-L1结合位点，如BMS-1、BMS-202等[12-13]．总之，这些阻断剂主要通过竞争性阻断PD-1/PD-L1蛋白间的结合，进而解除PD-1/PD-L1介导的免疫抑制信号．

PD-L1蛋白是由 290个氨基酸组成的可被糖基化修饰的 I型跨膜蛋白，在多种恶性实体瘤中高表达，如非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤等[14]，其蛋白表达水平因肿瘤类型不同而不同．肿瘤细胞逃逸免疫细胞与PD-L1蛋白表达紧密相连[15–16].尽管 PD-L1在肿瘤免疫中具有重要作用，但是对如何调控 PD-L1蛋白表达，进而促进抗肿瘤免疫活性研究较少，因此，寻找抑制肿瘤细胞PD-L1蛋白表达的小分子化合物具有重要研究意义．本文拟利用荧光素报告基因系统筛选抑制 PD-L1启动子活性的化合物，通过 RT-PCR、Western blot、细胞共培养体系、ELISA、小鼠成瘤等方法研究其调控 PD-L1蛋白表达和抗肿瘤免疫活性的作用．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、细胞、质粒与实验动物

大肠杆菌(E.coli)Top10购自Invirogen公司；子宫颈癌细胞 HeLa、乳腺癌细胞 MDA-MB-231、小鼠黑色素瘤细胞 B16购自北京协和医学院细胞资源中心；PD-L1启动子荧光素报告基因质粒 pGL4-hPDL1 本实验室构建[17]，pCMV-β-Gal购自 Thermo Scientific公司．C57BL/6小鼠(许可证 11400500028097)购自中国食品药品检定研究院．

1.1.2 主要试剂

DNA marker、PageRulerTMPrestained Protein Ladder、LipofectamineTM2000，Thermo Scientific 公司；细胞完全培养基 DMEM、RPMI 1640、胰酶，GIBIO 公司；青霉素、链霉素、L-Glutamine、荧光素、ONPG溶液，碧云天生物技术有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；小分子化合物库(L1300 Selleck FDA Approved Drug Library)，Selleck公司；hPD-L1抗体(EPR19759)、mPD-L1(EPR20529)，Abcam 公司；β-actin、Goat anti-rabbit IgG-HRP、Goat anti-mouse IgG-HRP，天津三箭生物技术有限公司；硫酸长春新碱(HY-N0488)，MCE公司；Mouse IL-2 ELISA kit、mouse γ-IFN ELISA kit，科诺迪生物技术有限公司．

1.2 方法

1.2.1 PD-L1表达抑制剂筛选

待HeLa细胞于3cm培养皿中长至70%～80%时，共转染 5μg pGL4-hPD-L1 和 1μg pCMV-β-Gal质粒，8h后换成新鲜培养基继续培养 12h，然后以15000个/孔的细胞密度铺 96孔板，24h后用 3%FBS的 DMEM 培养基稀释小分子化合物(终浓度1μmol/L)和等量 DMSO(作为对照)处理 HeLa细胞24h．弃培养基，每孔加入 100μL细胞裂解液，冰上裂解30min，每10min振荡一次．吸取40μL裂解样品于 96孔白板中，加入荧光素酶底物溶液 105μL，测定荧光素酶活性值；同时吸取 40μL裂解样品于96孔板，加入48μL Buffer Z(使用前每10mL buffer Z 缓冲液 36μL β–巯基乙醇)，再迅速加入 16μL 6mg/mL的 ONPG溶液，待有一个孔的溶液变黄时，测定 420nm 波长下的吸光度(β–半乳糖苷酶活性值)．

1.2.2 RT-PCR

分别用 DMSO和 10nmol/L硫酸长春新碱(vincristine sulfate，VCR)预处理 MDA-MB-231 细胞24h，Trizol试剂提取 Total RNA，并进行逆转录及PCR反应，依照说明书的方法进行操作，其中 RT反应条件：50℃ cDNA 合成 30min，85℃孵育5min．PCR反应条件：94℃预变性5min；变性30s，55℃退火 30s，72℃延伸 1min，29个循环；72℃延伸 5min．PD-L1和 β-actin引物序列分别为：PD-L1上游 5′-GACCTATATGTGGTAGAGTATGG-3′，下游5′-GGCATTGACTTTCACAG-3′；β-actin 上 游 5′-GGCATTGACTTTCACAG-3′，下游 5′-GGCATTGA CTTTCACAG-3′．用 2μg/mL PHA 诱导 Jurkat细胞48h后，按照上述方法提取 Total RNA并 RT-PCR，PD-1引物序列为：PD-1上游 5′-CCAGGATGGT TCTTAGACTCC-3′，下游 5′-GGCTGGCCTGGGTGA GGGGCTG-3′．

1.2.3 MTT法检测细胞活力

96孔板每孔接种 8000个细胞，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度梯度的 VCR，每个浓度梯度设置3个复孔．VCR 分别处理 24、48、72h后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃细胞培养箱继续培养4h，弃孔板内液体，每孔加入 200μL DMSO，水平振荡器上振荡10min，酶标仪测定490nm处吸光度．

1.2.4 MTT法检测Jurkat细胞对肿瘤细胞杀伤活性

DMSO和10nmol/L VCR分别处理MDA-MB-231细胞 48h，再分别接种于 96孔板，5000个/孔，设置 4个重复．待细胞贴壁后按照 E﹕T(Jurkat﹕MDA-MB-231)比为 4﹕1和 8﹕1的比例加入活化的 Jurkat细胞[18](2μg/mL PHA 预处理 Jurkat细胞48h)共培养 24h．每孔加入 20μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃细胞培养箱继续培养 4h，不吸出培养基直接每孔加入甲瓒裂解液[19-20]100μL，置于37℃培养箱中孵育 8h，水平振荡器上振荡 10min，酶标仪测定 570nm 处吸光度(A)．肿瘤杀伤率按照式(2)计算．

1.2.5 ELISA法检测小鼠血清细胞因子含量

用肝素抗凝管收集 C57BL/6小鼠血液，1000r/min离心10min，取上清液．按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测小鼠血清中 IL-2和 γ-IFN的含量．

1.2.6 小鼠成瘤实验

21只 6～8周龄的雌性 C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院，取培养至对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞 B16用生理盐水配制成为 1×107mL-1的细胞悬浮液，每只小鼠右前肢腋下接种 100μL细胞悬浮液．当观察到肿瘤出现后随机分为 3组，每组 7只，开始给药．给药浓度分别为 0.5mg/kg和1.5mg/kg，对照组给予等量生理盐水，每隔 1d腹腔注射给药一次，同时用游标卡尺测量肿瘤的长径(mm)和短径(mm)，按照式(3)计算肿瘤体积．在第13天处死小鼠，眼球取血，用于检测小鼠血液细胞因子分泌情况．同时剥离肿瘤，冻存于-80℃冰箱中，用于后续免疫印迹实验．

1.3 统计学分析

应用 SPSS软件进行数据的整理分析，采用 t检验进行组间比较，检验结果P＜0.05表示差异有统计学意义，*、**和***分别表示与对照组比较 P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001．

2 结果与分析

2.1 PD-L1表达抑制剂筛选

利用实验室保存的 PD-L1启动子荧光素报告基因质粒pGL4-hPD-L1和β–半乳糖苷酶报告基因质粒pCMV-β-Gal共转染 HeLa细胞，设置药物筛选浓度为 1μmol/L，筛选抑制 PD-L1启动子活性的小分子化合物，结果如图1所示．

图1 抑制PD-L1启动子活性小分子化合物的筛选Fig. 1 Screening of 311 small molecule compounds downregulating the activity of PD-L1 promoter

筛选了化合物库中 311种小分子化合物(图1(a))，其中硫酸长春新碱(VCR)具有浓度梯度依赖性抑制PD-L1启动子活性效果(图1(b))，在VCR浓度1μmol/L时抑制率约为60%．

2.2 VCR抑制MDA-MB-231细胞PD-L1蛋白表达

乳腺癌细胞系MDA-MB-231能够高表达PD-L1蛋白[21]．首先通过 MTT法检测 VCR对 MDA-MB-231细胞活力的影响，结果如图 2(a)所示．当药物处理浓度小于10nmol/L时，VCR对MDA-MB-231细胞活力影响较小．

图2 VCR抑制MDA-MB-231细胞中PD-L1表达Fig. 2 VCR suppressing PD-L1 expression in MDA-MB-231 cells

用10nmol/L VCR处理MDA-MB-231细胞24h后提取全 RNA，RT-PCR检测 PD-L1mRNA水平变化，结果如图2(b)所示，VCR下调MDA-MB-231细胞 PD-L1mRNA表达水平．不同浓度的 VCR处理MDA-MB-231细胞 48h后收集细胞，制备蛋白样品，免疫印迹实验(Western blot)检测 PD-L1蛋白水平变化．结果(图 2(c))显示，随着 VCR药物浓度增加，PD-L1蛋白水平呈浓度依赖性减少．以上结果表明，VCR通过下调 MDA-MB-231细胞 PD-L1基因的转录活性，进而抑制细胞PD-L1蛋白表达．

2.3 VCR增强 JurkatT细胞对 MDA-MB-231细胞的杀伤能力

植物血凝素(phytohemagglutination，PHA)能够诱导人 T淋巴细胞株 Jurkat细胞表达 PD-1[22]．用2μg/mL PHA诱导Jurkat细胞48h后，RT-PCR方法检测 Jurkat细胞 PD-1表达变化，结果如图 3(a)所示．与无 PHA 诱导相比，2μg/mL PHA 处理促进Jurkat细胞PD-1mRNA水平明显升高．

通过 Jurkat细胞和 MDA-MB-231细胞共培养，MTT法检测VCR处理MDA-MB-231后Jurkat细胞对其杀伤能力的影响，结果如图 3(b)所示．在 E﹕T比为 4﹕1和 8﹕1时，与 DMSO 对照组相比，用10nmol/L VCR处理组均能够增加 Jurkat细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤率．研究结果显示，当用VCR抑制 MDA-MB-231细胞 PD-L1蛋白表达后，阻断了由 PD-1/PD-L1信号介导的免疫抑制，从而增强Jurkat细胞对MDA-MB-231细胞杀伤作用．

图3VCR增强 Jurkat细胞对 MDA-MB-231细胞的杀伤作用Fig. 3 VCRenhancing the killing activity of Jurkat cells to MDA-MB-231cells

2.4 VCR抑制B16细胞PD-L1蛋白表达

由以上结果可知，VCR通过抑制 PD-L1启动子活性下调MDA-MB-231细胞PD-L1蛋白表达，然而VCR在体内是否通过抑制PD-L1表达而增强机体的抗肿瘤活性有待深入了解．由于 MDA-MB-231细胞在免疫系统正常的小鼠体内无法成瘤，而 B16细胞C57BL/6小鼠成瘤模型在PD-1/PD-L1抑制剂检测方面有着广泛的应用[23-24]，因此选择小鼠 B16细胞研究VCR对其在小鼠体内成瘤情况以及调控机体的抗肿瘤活性．首先，用不同浓度的 VCR处理 B16细胞48h后，收集蛋白样，Western blot检测 PD-L1蛋白表达情况，结果如图 4所示．VCR化合物浓度大于40nmol/L时，VCR处理 B16细胞中 PD-L1蛋白水平明显降低．以上结果表明，VCR能够下调 B16细胞PD-L1蛋白表达水平．

图4 VCR抑制B16细胞PD-L1蛋白表达Fig. 4 VCR inhibiting the expression of PD-L1 in B16 cells

2.5 VCR抑制B16在C57BL/6小鼠体内成瘤

将 B16细胞接种到 C57BL/6小鼠皮下成瘤，在接种第5天分别用0、0.5、1.5mg/kg VCR腹腔给药，每隔1d给药一次，共给药4次；同时测量肿瘤大小，第 13天处死小鼠前最后一次测量肿瘤大小，结果如图5所示．

与对照组相比，随着肿瘤生长时间的延长，0.5mg/kg 和1.5mg/kg VCR给药组的肿瘤生长受到显著抑制，其中 1.5mg/kg组肿瘤生长抑制更加明显．第 13天时 0.5mg/kg 和 1.5mg/kg VCR给药组的肿瘤体积和质量也明显小于对照组．对照组和0.5mg/kg组小鼠体重无差异，1.5mg/kg组体质量有略微下降，其中一只死亡．以上结果表明，VCR能够抑制 B16细胞在 C57BL/6小鼠体内成瘤，高剂量VCR会对小鼠产生毒副作用．

2.6 VCR调控C57BL/6小鼠抗肿瘤免疫活性

每组选取上述 5个黑色素瘤肿瘤组织通过研磨裂解制备样品，Western blot检测肿瘤组织中 PD-L1蛋白水平，结果如图 6(a)所示，与对照组相比，0.5mg/kg 和1.5mg/kg VCR给药组肿瘤组织中PDL1蛋白水平呈整体下降趋势．参与抗肿瘤免疫应答的 T细胞有很多种，其中细胞毒性 T细胞(Tc)和辅助性 T细胞(Th)在增强抗肿瘤免疫应答过程中发挥着主要作用，而Th细胞可以产生IL-2、γ-IFN等细胞因子增强机体免疫活性[25-26]．通过 ELISA 方法检测C57BL/6小鼠血清中细胞因子IL-2和γ-IFN含量变化，结果(图 6(b)和 6(c))显示，与对照相比，0.5mg/kg和 1.5mg/kg组均能够上调血清中细胞因子 IL-2和 γ-IFN水平．以上结果表明，VCR通过抑制B16细胞中PD-L1蛋白表达阻断PD-1/PD-L1信号，增加T细胞分泌IL-2和γ-IFN，从而增加机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用．

3 讨 论

VCR是从长春花中提取的一种生物碱，其作用于细胞微管蛋白，抑制微管聚合，从而干扰肿瘤细胞分裂[27]．临床上常作为抗肿瘤药物，主要应用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)、神经母细胞瘤[28]等，但由于其对神经系统和注射局部正常组织刺激性大，限制其临床应用[29]．目前临床上通常采用联合用药的方法降低 VCR的剂量，从而降低 VCR的毒副作用[30]，如无毒剂量的维拉帕米与低浓度 VCR联合使用可使其抑制胃癌细胞增殖作用增强 2.7～7.5倍[31]，VCR和甲基泼尼松龙联合对 ALL效果比单用 VCR效果显著[32]．本文研究显示：10nmol/L的VCR在体外下调乳腺癌 MDA-MB-231细胞 PD-L1mRNA水平和蛋白水平；VCR在体内抑制 B16细胞成瘤和PD-L1蛋白表达，并且上调 C57BL/6小鼠血清中细胞因子 IL-2和 γ-IFN的含量．这些研究结果表明，VCR可以通过抑制肿瘤组织细胞中PD-L1蛋白表达调控PD-1/PD-L1信号，并解除对肿瘤浸润性T细胞的抑制状态，从而增强 T细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤作用．

目前，免疫疗法联合用药越来越受到人们的关注，已有多种联合用药方案应用于临床并取得了令人意外的疗效[33]，如 keytruda/pemetrexed/carboplatin三药联合已经成为转移性非鳞状 NSCLC的一线治疗药物[34]．三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)发病率约占乳腺癌的 15%，是乳腺癌的一种独立临床病理类型，具有预后差、侵袭能力强等特点[35]．由于其具有独特的生物学特征，现有的内分泌治疗和分子靶向治疗等治疗方式不能满足 TNBC患者治疗的临床需求[36]．研究发现黑色素瘤相关抗原3(melanoma associated antigen 3，MAGEA3)在多达40%的 TNBC患者中特异性表达，可以作为肿瘤疫苗靶点用于 TNBC患者的临床治疗[37]．本文发现VCR在纳摩尔水平就可以抑制乳腺癌细胞 MDAMB-231 PD-L1蛋白表达，同时也发现高剂量 VCR给药会对小鼠有毒副作用．因此，适合剂量 VCR与MAGEA3肿瘤疫苗联合使用，有望改善单药治疗在临床应用上的局限性，使患者获得更大的治疗效果．