单细胞测序技术及其在乳腺癌中的应用进展

杜彦宏，季雄娟

（无锡市锡山人民医院检验科，江苏 无锡 214105）

1 单细胞测序技术概况

SCS技术是一种在单细胞水平上分析基因组、转录组及表观遗传的强大的方法，近几年来，测序技术方面已取得了大量突破。2013年，首次利用SCS技术对肿瘤病人单个外周血循环肿瘤细胞进行全基因组、外显子组测序，为无创肿瘤诊断和监测提供了一种新的技术手段[2]。

2 单细胞测序技术原理[3-8]

单细胞测序技术主要包括单细胞基因组测序、转录组测序、表观遗传学测序及多组学测序。

2.1 单细胞基因组测序

对目的细胞的全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增，随后进行高通量测序，进而在全基因组水平上研究肿瘤进化、配子发生、体细胞嵌合现象。

2.2 单细胞转录组测序

对采集患者样本的几乎所有转录本进行测序，揭示了胚胎早期发育、细胞分化和细胞重编等过程中的动态基因表达和相关的基因调节网络。

2.3 各种表观遗传学测序

表观遗传学是描述基因组功能上的相关改变，不涉及非致瘤性单细胞核苷酸序列的改变，能更准确描述单个肿瘤细胞的基因组命运。表观遗传包含细胞中所有遗传标记及其染色体的表型，定义细胞发育和癌症进展的每个阶段进而决定了细胞的异质性。其中单细胞甲基化组测序刚刚起步，为个性化肿瘤治疗提供依据，在癌症和干细胞研究中显示出巨大潜力。

2.4 多组学测序

同时进行单细胞基因组和转录组两组测序，可以采用微流体的方式将两者分离进行测序或者采用物理方法将两者分离测序。也可同时进行三重组学的测序，从而可以同时得到来自同一细胞的基因组、转录组和DNA甲基化的信息。还有许多其他方面的测序尝试仍在继续。

3 单细胞测序技术方法

单细胞测序技术主要包括以下4个步骤：单细胞分离获取，DNA或RNA序列扩增，基因测序及数据分析。

在五原盐碱地治理的过程中，各企业、院校、科研机构以土地流转的形式参与到盐碱地治理中，其中以硅谷肥业尤为突出，共计流转3000多亩土地，其中包括800多亩轻度盐碱土地、1000多亩中度盐碱土地、1200亩核心重度盐碱土地。硅谷公司采取多种肥料结合，多种施肥方案，多种作物种植等方式，针对流转区域进行改良，并取得显著成效。同时，硅谷肥业还在五原的丰裕办事处、新公中镇、复兴镇等实施惠农措施，并开展了多个盐碱治理示范园区。硅谷有机硅功能肥在五原县盐碱地改良治理的成功获得了农业农村部耕保中心和多个省、市、地区的农业技术及相关部门、科研机构的关注。

3.1 单细胞分离获取[9-15]

单细胞标本传统上是从肿瘤组织或体液的活检中获得的，为了从大量混杂细胞中分离出目标细胞需要选择以下方法（无限稀释法、单细胞显微镜操作法、流式细胞仪分选细胞法、激光捕获显微切割法、微流控技术等），这些方法各有利弊，要根据具体的情况进行方法的选择。

3.1.1 无限稀释法

将目的细胞群从新鲜组织中分离出来，然后放入悬浮液中，进行倍比稀释，直至获得单个目的细胞。该方法的局限性在于操作员对技术的掌握程度，分离多个细胞的较高概率以及较低的获取率。

3.1.2 单细胞显微镜操作法

在高倍镜下分选细胞，但有操作难度大，获取数量较少的缺点。

3.1.3 流式细胞仪分选细胞

通过荧光标记，根据细胞各自的特性，分选单个细胞或细胞群的技术。

3.1.4 激光捕获显微切割

利用激光脉冲将目标切片附在有热塑膜的涂片上，进而实现细胞分离。主要应用于癌症单细胞的分离研究。

3.1.5 微流控技术

利用微流控芯片上的微管道进行多种单细胞分选。这种方法可以批量测序所有的基因，从而降低了单细胞测序的成本，提高了测序效率，同时也方便了研究者。因此，微流控技术是目前最理想的单细胞分离方法，具有广阔的应用前景，值得进行规模化的推广和应用。

3.2 DNA或RNA序列扩增

由于现阶段任何测序技术都无法直接对单个细胞提取的微量核酸进行检测，故必须通过全基因组扩增和全转录组扩增技术，获取到足量的核酸，从而构建DNA或RNA文库，为分析基因突变和拷贝数改变以及确定单个细胞中特定的细胞基因表达提供了基础。测序结果的正确与否取决于单细胞DNA和RNA扩增的数量和质量，所以DNA和RNA扩增方法的选择显得尤其重要。

3.2.1 全基因组扩增

将单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，通过外显子捕获进而高通量测序用于揭示细胞群体差异。常见的方法有聚合酶链反应法（PCR）、多重置换扩增技术（MDA）。PCR法是第一个针对SCS开发的方法但扩增效率低，MDA法已被广泛报道，从单细胞基因组或外显子组可以获得高的物理覆盖率（＞90%），这是测量碱基突变的理想方法[16]。近年，又有一种方法，Stepanauskas[17]等提出了一种组合M D A 和FA C S 并改进的方法，即WGA-X。该方法增强了单个微生物细胞和病毒基因组回收效率。

3.2.2 全转录组扩增技术

全转录组扩增技术是SCS的关键步骤，RNA测序的第一步是开发有效的全转录组扩增方法。单细胞转录组扩增的方法主要有唐氏法（Tang's method）、Smart-seq1、Smartseq2、线性扩增法等。但SMART技术不稳定，低水平表达的转录组可能会丢失[18-19]。在过去的几年里，扩增技术取得了很大的进展，单个细胞转录组扩增技术中存在的弊端逐渐被修复。

3.3 基因测序

利用各种测序方法，分析DNA或RNA碱基序列、基因的表观遗传修饰。

3.4 数据分析

数据分析是指通过各种算法对测序结果进整理筛选，从测序结果中获取有用信息的一种方法。目前单细胞测序技术仍存在多种固有技术错误，改进生物信息学分析技术是关键。随着技术不断发展，SCS技术及其在肿瘤个体化治疗中的应用前景广泛[20]。

4 单细胞测序在乳腺癌中的应用进展

4.1 揭示乳腺癌细胞的异质性，指导个体化治疗

2017年chung等[21]分析了来自11名患者的515个细胞。从单细胞RNA-seq数据中推断出的拷贝数变化，从而将癌细胞与非癌细胞区分开。在单细胞分辨率下，乳腺癌细胞在肿瘤内表现出一部分相同的特征，以及发现了与乳腺癌亚型和关键的肿瘤通路有关的瘤内异质性。大多数非癌细胞是免疫细胞，有三种不同的T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞。T淋巴细胞和巨噬细胞均表现出免疫抑制特征：T细胞具有调节或衰竭表型，巨噬细胞具有M2表型。这些结果说明乳腺癌转录组具有广泛的瘤内异质性，瘤内异质性是导致临床治疗无效的原因之一[22]。因此了解乳腺癌异质性水平以及微环境基因表达可能有助于确定更好的预后和治疗的分子靶点，进行精准治疗。

4.2 分析乳腺癌转移和进展

循环肿瘤细胞（CTC）来源于原发肿瘤，通过循环迁移到其他部位从而导致肿瘤患者大部分死亡。2015年，Lawson等[23]利用单细胞测序对不同分期的转移性乳腺癌进行基因表达分析，揭示了原发肿瘤，CTCs和转移癌细胞的个体基因组的之间的关联。对 CTCs 进行单细胞测序主要具有两大应用价值：一是操作过程更加简化且得到纯度更高的肿瘤细胞；二是对样本质量的要求更低，能够对所含有的微量DNA或RNA做出精准分析。总而言之，单细胞测序检测CTCs能更好的提示转移性乳腺癌患者的预后和对治疗的反应[24]。

4.3 探索乳腺癌耐药机制

由于肿瘤耐药而复发的患者不计其数，这也是肿瘤治疗无效的原因之一。三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性亚型肿瘤，常发生化疗耐药。2018年，Kim等[25]使用了单细胞DNA和RNA测序对20例三阴性乳腺癌患者的化疗前和化疗后的肿瘤组织进行测序，结果表明，耐药基因型是预先存在的，但肿瘤细胞的耐药表达谱是在化疗后经转录重编码而获得的。这个发现对于克服乳腺癌的化疗耐药及寻找新的治疗靶点具有积极作用。

5 小结与展望

随着单细胞测序技术的发展，在探寻乳腺癌的异质性，进化过程，转移及耐药性等方面成为有力的工具。但目前单细胞测序技术对乳腺癌的研究尚且单一，不能完整的揭示整个肿瘤的发生发展、转移及耐药的过程，突破单细胞甲基化组测序是我们新的方向。我们目前为止所讨论的单细胞测序技术只能描述遗传信息的一个维度，我们希望未来有望利用在单细胞水平进行基因组、转录组、表观基因组等多种组学的综合研究合并分析，从而更加系统全面地分析乳腺肿瘤细胞的基因变化，有助于临床中对乳腺癌患者的个体化靶向治疗，提高疗效，实现个体化精准医疗。