猪伪狂犬病毒流行株的分离鉴定及其毒力试验

骆辉，王雪涛，廖果，谢伟，罗旭，阴文奇，周远成*

（1.畜科生物工程有限公司，畜禽生物制品四川省重点实验室，四川省动物生物制品工程技术研究中心，四川 成都 610200；2.四川省乐山市动物疫病预防控制中心，四川 乐山 614000）

猪伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病毒（PRV）所引起的猪、牛、羊等多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病。猪是该病的天然宿主、主要储存宿主和传染源，无论是新生仔猪、育肥猪，还是成年种猪均可感染PRV，从而造成巨大的经济损失[1-2]。2 周龄内仔猪感染PRV 后死亡率较高，有的可达100%，常伴有腹泻、呕吐及共济失调、角弓反张等神经症状；断奶仔猪也能引起死亡，但主要表现为呼吸系统症状，也有部分猪出现神经症状、腹泻、呕吐等，耐过的仔猪往往发育不良，成为僵猪；育肥猪感染后可出现体温升高、呼吸困难，主要以呼吸道症状为主，死亡率较低；成年猪感染后不发病或仅表现为体温升高等轻微症状，呈隐性感染，长期带毒或排毒，成为最危险的传染源；妊娠母猪感染后会导致流产、产死胎和木乃伊胎等；种猪感染可致不育、睾丸肿胀，母猪返情、屡配不孕等[3-4]。

2011 年以来，我国多个省份出现免疫PRV疫苗的猪场发生猪伪狂犬病的案例，发病率和死亡率明显上升，且出现了新的发病特征，给中国养猪业造成了极大的损失，引起了业内高度重视[5]。本试验分别从国内多个地区采集了11份疑似猪伪狂犬病的病料，开展PRV流行毒株的分离与鉴定，并对不同地区分离的流行毒株进行基因同源性分析和毒力试验，为猪伪狂犬病的防控提供新的试验数据。

1 材料

1.1 病料来源 2015～2018 年，从四川南充、遂宁等地共采集猪伪狂犬病毒疑似阳性病料6 份，从湖北不同养殖场共采集猪伪狂犬病毒疑似阳性病料2 份，从江西不同养殖场共采集猪伪狂犬病毒疑似阳性病料3份，共计11份。所有疑似阳性病料都保存于畜禽生物制品四川省重点实验室。

1.2 细胞与试剂 PK-15细胞，由畜禽生物制品四川省重点实验室提供；新生牛血清、DMEM 细胞培养基均购自GIBCO 公司；TAKARA MiniBest Viral RNA∕DNA Extraction Kit试剂盒购自TAKARA公司；猪伪狂犬病毒gB、gE ELISA抗体检测试剂盒购自IDEXX公司；PCR检测相关试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 试验动物 8～9 周龄猪伪狂犬病毒gB、gE ELISA 抗体呈阴性的健康试验猪，购自成都某猪场。

2 方法

2.1 病料处理 将采集的病料组织加液氮研磨后，用无血清的DMEM培养液按1∶5混合制成组织悬液，放置-70℃以下冰箱中冻融1次，以12000r∕min离心10 min，取上清液使用0.45 μm 滤膜过滤后，再次以12 000 r∕min 离心30 min，取上清液进行病毒分离。取0.5 mL 处理好的组织液接种致密单层的PK-15传代细胞，置37℃、5%CO2培养箱中吸附1h，倒掉病毒液，加入无血清DMEM培养液；再次置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每日观察细胞是否出现CPE，同时设正常细胞对照。连续观察5日，若未出现CPE，则取细胞培养液再次接种长满单层的PK-15 细胞进行盲传，直至出现CPE。当CPE 达75%以上时，取培养液上清继续接种长满单层的PK-15 细胞进行病毒传代。当接种病毒的细胞出现CPE 后，连续传代5 次，所有收获的病毒液于-80 ℃保存。

2.2 外源病毒检验 取出现CPE 以后代次的病毒液，按TAKARA MiniBest Viral RNA∕DNA Extraction Kit 试剂盒的方法提取核酸，分别以本实验室建立的猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2 型、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、支原体的PCR检测方法进行病毒核酸检测。

2.3 病毒含量测定 将分离的PRV 流行毒株，用无血清DMEM 培养液进行10 倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74 个稀释度，分别接种于已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔PK-15细胞培养板，每个稀释度接种6 孔，每孔0.1 mL，同时设正常细胞对照。置37 ℃、含5% CO2培养箱中吸附1 h 后，每孔补加含4%新生牛血清的DMEM培养液0.1 mL。再次置37 ℃、含5%CO2培养箱中培养观察5日，根据Reed-Muench法计算TCID50。

2.4 病毒中和试验鉴定 将分离的猪伪狂犬病毒流行毒株，用无血清DMEM培养液分别稀释成103TCID50∕mL的病毒悬液，与56 ℃灭活30 min的猪伪狂病毒特异性血清等量混合，置37 ℃作用1 h；接种于已长满单层PK-15细胞并弃去细胞培养液的12 孔培养板，每孔0.2 mL，同时设病毒对照和正常细胞对照（每组2 孔）。置37 ℃、含5%CO2培养箱中吸附1 h 后，每孔补加含2%新生牛血清的DMEM 培养液3 mL，再次置37 ℃、含5%CO2培养箱中培养观察5日，记录各孔CPE情况。

2.5 不同流行毒株主要基因序列分析 根据PRV 基因组特征设计引物扩增gB、gC、gD、gE 基因序列全部或部分片段，阳性扩增产物送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行序列测定（表1），使用DNAstar 和MEGA 7.0 分析软件进行核苷酸和氨基酸序列的差异比较，并构建遗传进化树。

2.6 毒力试验 将鉴定合格的猪伪狂犬病毒流行毒株，每个毒株选用1 个代次进行毒力试验。将待检病毒稀释成106.0TCID50∕mL，每个分离株接种8～9 周龄PRV gB、gE 抗体呈阴性的健康仔猪5 头，每头滴鼻接种3 mL。接种前观察2～3 日，每日定时测体温1 次，取其平均值作为基础体温。接种后连续观察21日，每日定时测量体温1次，观察试验猪精神、食欲是否正常，是否出现呼吸困难、神经症状等伪狂犬病相关临床症状，同时记录试验猪死亡情况。

表1 PRV主要结构蛋白扩增引物序列信息

3 结果

3.1 病毒分离结果 从11份猪伪狂犬病疑似阳性病料中共分离到6 株病毒，其中从四川采集的6 份病料中分离到3 株病毒，分别命名为SCHS株、SCM1 株、SCY1 株；从湖北采集的2 份病料中分离到1株病毒，命名为HBA1株；从江西采集的3 份病料中分离到2 株病毒，命名为JXHS 株与JXN1株。

3.2 外源病毒检测结果 从四川分离的3 株病毒中，SCHS 株与SCM1 株仅PRV 检测结果为阳性，其余检测结果均为阴性，SCY1株的PRV与支原体检测结果均为阳性。从湖北分离的HBA1株的PRV、PCV2 与支原体检测结果均为阳性。从江西分离的JXHS 株仅PRV 检测结果为阳性，JXN1 株的PRV 和PCV2 检测结果均为阳性。病毒纯净性检验结果见表2。

表2 猪伪狂犬病毒分离株的PCR检测结果

3.3 病毒含量测定结果（表3） SCHS株与JXHS株在PK-15 细胞上适应良好，F5～F10 代的最高病毒含量分别为107.4TCID50∕mL、107.75TCID50∕mL；SCM1 株、SCY1 株、HBA1 株、JXN1 株F5～F10 代的最高病毒含量在106.4TCID50∕mL左右。

3.4 中和试验鉴定结果 用纯净性检验仅PRV呈阳性的SCHS株、SCM1株、JXHS 株进行中和试验鉴定，结果显示3 株分离病毒均能被猪伪狂犬病毒特异性血清中和。

表3 猪伪狂犬病毒分离株的病毒含量测定结果

3.5 不同毒株主要基因序列分析 使用所设计的引物成功扩增出6个分离毒株的部分gB、gC基因和全长gD、gE 基因，对扩增阳性产物进行序列测定，获得了6 个毒株的主要结构蛋白基因序列。通过DNAstar 软件分析，发现所分离毒株HBA1、JXN1、SCY1 的gB 扩增片段核苷酸序列与JS-2012株的同源性为100%，其余毒株的gB扩增片段核苷酸序列与JS-2012株的同源性为99.7%～99.9%，与Bartha 株的同源性在95.4%～95.6%之间。JXHS、SCHS、JXN1 的gC 基因与JS-2012 株的同源性为100%，其余毒株的gC基因与JS-2012株的同源性为99.5%～99.8%；所有分离毒株的gC 基因与Bartha 株的同源性均在90.7%～91.2%之间。SCY1 株、SCM1 株、JXHS 株的gD 基因与JS-2012 株的同源性为100%，其余毒株的gD 基因与JS-2012株的同源性为99.8%或99.9%；所有分离毒株的gD基因与Bartha株的同源性在98.7%～98.9%之间。所有分离毒株的gE 基因与JS-2012株的核苷酸同源性在99.1%～99.8%之间。

选择近年来我国流行的PRV 流行毒株和PRV 经典毒株的相应序列，构建gB、gC、gD 和gE基因序列的遗传进化树，结果显示4 个主要结构蛋白基因序列的分析结果一致，PRV 呈现2 个不同基因型分支，即：以Bartha株为代表的基因1型和我国分离株形成的基因2型。本试验分离的毒株均为基因2 型毒株，与当前我国主要流行毒株的遗传关系接近。

3.6 不同毒株的毒力试验结果 用纯净性检验仅PRV呈阳性的SCHS株、SCM1株、JXHS株进行毒力试验，结果显示3 个流行毒株均能导致8～9周龄试验猪100%（5∕5）发病。用SCHS 株攻毒后全部试验猪（5∕5）都出现呼吸道症状，观察期内有3∕5 死亡；用SCM1 株攻毒后有4∕5 的试验猪出现呼吸道症状，观察期内有1∕5 死亡；用JXHS 株攻毒后有2∕5 的试验猪出现呼吸道症状，观察期内全部存活。不同毒株的毒力试验结果见表4。

表4 猪伪狂犬病毒不同分离株的毒力试验

4 结论与讨论

2011 年前后在全国范围内出现了新的猪伪狂犬病疫情，主要表现为突发性大面积种猪流产，育肥猪致死性感染，猪群gE 抗体阳性率突然升高，部分猪场的gE 抗体阳性率高达100%。疫情发生的地区不同、免疫状况不同而呈现出不同的临床表现。免疫状况较好的猪场，大多无明显临床症状，但猪群gE 阳性率突然升高；免疫状况较差的猪场，主要表现为种猪大面积流产、仔猪腹泻、育肥猪出现呼吸道症状与急性死亡[6]。

新疫情发生以后，全国多个实验室分离到新的猪伪狂犬病毒流行毒株，经过致病力试验、免疫保护试验和分子流行病学研究，一致认为新流行的猪伪狂犬病毒株在主要毒力基因gE、gI以及与免疫保护相关的基因gB、gC、gD上存在多个位点的变异[7-9]。从我国不同地区分离的新流行毒株，与目前广泛使用的猪伪狂犬病活疫苗Bartha K61 毒株位于不同的基因亚型，动物试验与中和抗体检测均证实Bartha K61 毒株对我国猪伪狂犬病免疫保护的效果较差，其保护力低于50%，而使用流行毒株构建的基因缺失疫苗能够为仔猪提供100%的免疫保护[10-12]。本试验分离的6株猪伪狂犬病毒主要基因位点与国内猪伪狂犬病毒流行毒株JS-2012 株的同源性均在99%以上；与Bartha K61 株gB 基因的同源性约为95%，与gC 基因的同源性在90.7%～91.2%，与gD 基因的同源性在98.7%～98.9%。基于主要基因位点的遗传进化分析结果显示，猪伪狂犬病毒已呈现2个不同的基因型分支，即：以Bartha株为代表的基因1型和我国流行的基因2型。本试验分离的毒株均为基因2 型毒株，与当前我国主要流行毒株的遗传关系接近。

猪伪狂犬病毒只有一个血清型，但不同毒株在毒力和生物学特征等方面存在差异。本试验分离的猪伪狂犬病毒SCHS 株、SCM1 株与JXHS株无外源病毒污染，滴鼻感染8～9 周龄试验仔猪，均能导致试验猪全部（5∕5）出现体温反应，但不同毒株的毒力存在较大差异。SCHS株攻毒后全部（5∕5）出现呼吸道症状，观察期内有3∕5死亡；SCM1株攻毒后有4∕5出现呼吸道症状，观察期内有1∕5 死亡；JXHS 株攻毒后有2∕5 出现呼吸道症状，观察期内全部存活。

SCHS、SCM1、JXHS 这3 个纯净的猪伪狂犬病毒流行毒株均能导致易感动物发病，成功地构建了猪伪狂犬病流行毒株的攻毒模型。本试验有助于进一步评价不同毒株活疫苗对我国当前PRV流行毒株的攻毒保护效果，为猪伪狂犬病疫苗的评价，灭活疫苗及新型弱毒疫苗的研发提供新的依据。