辣椒品种苗期耐低磷评价及低磷适应性类型划分

唐荣莉, 王春萍，王红娟, 韩 垚，雷开荣

(重庆市农业科学院生物技术研究中心/逆境农业研究重庆市重点实验室，重庆 401329)

【研究意义】土壤中有效磷缺乏是辣椒(Capsicumannuum)高产、稳产的重要影响因素之一。在低磷胁迫情况下，同一种作物的不同品种对磷素吸收利用效率存在差异，某些品种对低磷胁迫环境的适应度更高。筛选和培育耐低磷能力强的品种，是提高辣椒磷素利用效率、减少过量施用磷肥、降低环境污染的有效途径之一。而开展辣椒品种苗期耐低磷鉴定指标和评价方法研究，是快速有效筛选耐低磷品种的重要基础，具有重要的应用价值和生产意义。【前人研究进展】作物耐低磷特性是由多基因控制的性状或多种因素相互作用的结果[1-2]。合理的选择与缺磷密切相关且容易检测的指标并建立科学的综合评价方法可以显著提高磷素高效利用品种的选择效率。在作物逆境响应及耐性鉴定指标方面，植物表观性状指标是最易观察和测定的指示因子，现阶段研究表明，植物的株高、叶面积、生物量及元素分配、根系长度、表面积、体积、根尖数、分叉等形态结构性状均对营养缺乏的逆境表现出一定程度的响应特征[3-6]。这些指标间既存在一定的特异性，也往往存在信息重叠现象。在评价方法方面，一些学者针对其中几个最为敏感的指标建立了评价体系。例如，刘灵等针对大豆(Glycinemax)对低磷胁迫的反应，考虑生物量、磷累积量、产量等指标从磷效率和敏感性等方面将作物的基因型划分为磷低效不敏感型、磷低效敏感型、磷高效敏感型及磷高效不敏感型4种类型[7]。高家合等考虑生物量和磷累积量等养分效率及指标，将烟草(Nicotianatabacum)划分为磷低效低产型、磷低效高产型、磷高效高产型及磷高效低产型[8]。但由于使用指标较少，这些评价方式可能会遗漏关键信息。为更有效和全面地探讨逆境胁迫下作物的抗性特征，国内外学者在综合评价方法上也进行了一系列的探索，例如：王春萍等探讨了利用8个关键指标和模糊隶属函数分析法在苗期对辣椒耐低氮水平进综合鉴定的方法[9]；徐小万等用灰色关联分析探讨了辣椒生理生化性状与耐高温高湿的关系[10]；郑金凤等利用主成分分析开展了小麦代换系耐低磷生理性状特征指标构建[11]；冯琳等结合主成分分析和偏最小二乘回归分析了不同基因型棉花根系对局部供磷的响应特征[12]。这些研究通过建立综合指标和单项指标之间的最优回归方程，在保证指标有效信息不丢失的情况下，压缩了冗余，可用于辨析作物品种对胁迫耐性或敏感性的大小。【本研究切入点】目前关于辣椒耐低磷材料的鉴定评价研究鲜有报道，更缺乏对市售辣椒品种苗期耐低磷特性的评价。为有效指导实际生产，快速和合理评价辣椒品种耐低磷特征，本研究运用植物生理学和根系生物学等学科的相关理论和技术，以不同辣椒品种在低磷胁迫下的生长发育、形态结构、根系特征等表观性状的低磷系数为基础，运用多种方法建立了综合评价指标。【拟解决的关键问题】提出一套较完善的辣椒苗期耐低磷研究方法，测算供试辣椒的综合耐低磷系数，划分辣椒的低磷适宜性类型。从而为同类型研究提供方法参考，为辣椒耐低磷品种资源的发掘与利用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以西南地区广泛种植的22种市售辣椒品种为材料(表1)进行辣椒苗期耐低磷评价方法研究，供试辣椒包含了市售常用栽培品种，涵盖灯笼型、牛角型、朝天椒、线椒等类型，种子由重庆市农业科学院生物技术研究中心提供。

表1 供试辣椒的基本特征

续表1 Continued table 1

1.2 试验设计

1.2.1 育苗 采取实验室内恒温培养的方法，于2017-2018年在逆境农业研究重庆市重点实验室人工气候室进行辣椒培养试验。挑选饱满一致且无病虫害的22份辣椒材料的种子，经过温汤浸种、搓洗沥干水分后均匀放入盛有2层湿润滤纸的培养皿中，置于人工气候箱内25～28 ℃黑暗条件下发芽。将发芽后的种子用蒸馏水清洗后单株移到具有3排共15个Φ=0.5 cm的圆孔的黑色海绵漂浮板上，随后悬浮于大小与漂浮板匹配的装有蒸馏水的黑色塑料培养盒中，使用蒸馏水育苗1周后再进行1周1/2浓度的霍格兰营养液的过渡培养，随后进行低磷和对照处理。

1.2.2 营养液配置 试验采用霍格兰营养液培养辣椒，利用前期建立的耐低磷鉴定体系，并参考其他同类文献的低磷浓度水平[13-14]，设正常(CK)和低磷(1 %)共2个浓度进行辣椒耐低磷试验处理。其中CK处理的营养液组成为(mmol/L)：1.0 KH2PO4，1.25 MgSO4，2.5 KCl，2.5 KNO3，2.5 Ca(NO3)2，0.4625 H3BO3，6.722×10-3MnSO4，3.16×10-3CuSO4，5×10-4Na2MoO4，7.65×10-4ZnSO4，0.02 Fe-EDTA。低磷处理是将供磷营养液中的KH2PO4浓度降低到CK的1 %，即KH2PO4为10 μmol/L，K成分用KCl代替，其他组分不变。各处理营养液pH调节至6.2～6.4。

1.2.3 培养条件 每种处理培养3盒植株，以1盒即15棵植株为1个重复。对14 d苗龄辣椒幼苗进行低磷胁迫处理30 d，培养过程中，每3～4 d更换1次相应处理营养液500 mL。培养条件控制为：温度25～28 ℃，光照12～14 h/d，光照强度4600～6000 lx，空气相对湿度70 %～80 %。更换营养液前用蒸馏水将植株根部残留营养液清洗干净[9]。

1.3 测定项目与方法

辣椒幼苗收获后，对代表植株干物质特征、叶面积特征、磷含量、根系特征的性状进行观察，获取单株根干重、单株茎干重、单株叶干重、根磷含量(%)、茎磷含量(%)、叶磷含量(%)、株高、叶面积、根长、根系投影面积、根系表面积、根系平均直径、根体积、根尖数、分支数共15个指标值。

1.3.1 叶面积指标测定 使用CI-202便携式叶面积仪获得辣椒样品单株叶面积数据。

1.3.2 根系指标测定 将剪下的辣椒根系在根盘中分散开置于根系扫描仪上进行扫描，每个处理随机选取3株作为重复。使用WinRHIZO根系分析软件测定各指标测量根系表面积、根系总长度、根体积、根直径、根系分支数、根尖数等衡量根系大小及形态结构的指标值。

1.3.3 株高及质量测定 用直尺测量每株样品株高，将植株根茎叶用剪刀分离，处理及对照按重复水平分别装入信封中，将植株置于烘箱中，105 ℃杀青10 min，然后在75 ℃烘干至恒重，分别称量根、茎、叶干重，精确到小数点后4位。

1.3.4 磷含量测定 将植株各器官组织烘干粉碎后，采用浓H2SO4-H2O2消煮，使用钒钼黄比色法在722紫外-可见分光光度计450 nm处比色测定辣椒根、茎、叶样品的磷含量。

1.4 数据处理与统计分析

所获得数据用Excel、SPSS10.0及Canoco5.0软件进行统计学分析和作图。

1.4.1 基本数据处理 根据测定指标计算辣椒植干重根冠比、磷含量根冠比、磷吸收及利用效率等指标。其中磷吸收效率(mg/g)按照Elliott和Läuchli[15]的方法计算，磷利用效率(g/mg)按照Siddiqi和Glass[16]的方法计算。为消除不同辣椒品种间固有的生物学差异，本研究采用耐低磷系数[low phosphorus tolerance coefficients(LPTC)]来衡量基因型间的差异[14]。具体公式如下：

A=Pt/RDW

(1)

式中，A代表磷吸收效率，Pt代表整个植株吸磷量，RDW代表根系干质量。

E=SDW/Ps

(2)

式中，E代表磷利用效率，SDW代表地上部干质量，Ps代表地上部磷含量。

LPTC=M/CK

(3)

式中，LPTC代表耐低磷系数(后面的论述将分别以X、Y来具体表示)，M代表低磷处理下各指标测定值，CK代表对照条件下各指标测定值。

1.4.2 主成分分析 主成分分析是一种使用最广泛的数据降维算法。该方法通过将X维特征映射到具有正交特征的Z维主成分上，实现对数据的降维处理。本研究使用SPSS软件将原来多个彼此相关的指标转换成新的少数几个彼此独立的综合指标，从而建立综合指标Zj。

1.4.3 综合评价 利用以下公式[17]计算各辣椒品种低磷综合评价值(D)：

(4)

(5)

1.4.4 基于Canoco的排序分析 排序分析是将样方排列在一定的空间，使得排序轴能反映一定的梯度，从而解释样方分布与因子的关系。使用排序方法可以在多个实际或虚拟坐标轴上将辣椒品种一个个进行排列并产生排序结果图[18]。本研究使用PCA生成的多个综合指标结合Canoco5.0软件对辣椒品种的耐低磷特征进行排序，通过建立辣椒品种之间相似(相异)矩阵和综合指标之间的相关矩阵生成排序图，从而解读辣椒品种之间低磷耐策略的关系、不同辣椒品种与各个耐低磷综合指标的关系。

2 结果与分析

2.1 辣椒对低磷条件的响应特征及指标间的相关性

2.1.1 低磷处理下辣椒形态和生理性状的变化 根据所测得的数据，利用公式(3)求得各辣椒品种各性状的耐低磷系数X(表2)。该指数大于1表明低磷增加了该性状的测定值，小于1说明低磷降低了该性状的测定值。由表2可见，与CK相比，低磷处理辣椒的单株根干重、根长、根系投影面积、根系表面积、根体积、根分支数等性状值普遍增加；单株茎干重、单株叶干重、根磷含量(%)、茎磷含量(%)、叶磷含量(%)、植株高度、叶面积等性状值普遍表现为下降；而平均直径、根尖数等性状值表现出增加或减少的品种相当。即低磷处理使辣椒幼苗多个指标都发生了显著变化，形态变化主要表现为叶片数降低、叶面积变小，根系伸长变细，侧根与根毛的数量和长度增加，株高降低，生物量及其分配特征变化主要表现为地下部分干物质量增加以及地上部干物质量降低；生理变化主要体现在低磷处理下辣椒植株的根茎叶的磷百分含量都显著降低。受不同的环境适应能力及响应策略的影响，不同辣椒品种处理和对照之间生长状况差别较大。

表2 不同基因型辣椒品种各单项指标的耐低磷指数

续表2 Continued table 2

2.1.2 各性状低磷系数的相关分析 对各性状指标的耐低磷指数进一步利用Canoco5.0软件进行的相关分析，22个不同品种的辣椒品种的各性状耐低磷指数(Xn)的相关关系如图1所示。图中箭头代表各指标的耐低磷指数，指标间夹角余弦值展现指标间的正负相关性，即两种指标夹角越小相关性越紧密，当两夹角为90°时代表不相关，超过90°的时候，则表明为负相关。从图1可以看出，考查的各单项性状间存在不同程度的相关性，使得它们所提供的信息发生重叠，因此从这些单项指标上评价其耐低磷特征难以得到客观的结果。

图1 各单项指标的耐低磷指数相关性特征Fig.1 Correlation characteristic of different indicators

2.2 基于生物量分配利用的辣椒耐低磷特征评价

生物量是植物生长积累的物质基础，低磷逆境环境下，植物会调整磷素使用策略和生物量分配策略应对逆境伤害[19-21]，因此，辣椒苗期在低磷条件下的生物量分配及磷素分配特征可以表征苗期的耐低磷性能差异。目前，干重根冠比，磷含量根冠比、营养元素的吸收效率、利用效率等反映磷吸收与生物量的磷响应方式的指标，常常被用来辅助评价作物在逆境胁迫下的抗性特征[22-23]。

利用公式(3)求得各辣椒品种干重根冠比、磷含量根冠比、营养元素的吸收效率、利用效率的耐低磷系数Y。从表3可以看出，干重根冠比LPTC的范围为1.04～2.98，磷含量根冠比LPTC的范围为0.41～3.01，磷吸收效率LPTC的范围为0.04～0.69，磷利用效率LPTC的范围为1.11～9.98。即在低磷胁迫下，辣椒普遍会提高干重根冠比及磷利用效率，降低磷吸收效率以及改变磷含量在根冠的分配比例来适应逆境，且不同品种之间差异较大。就结果而言，这几个指标对不同品种的核算结果既有相似性，也具有差异性。其中，就干重根冠比LPTC而言，83、1021、T1最大，T22、T17、T23最小；就磷含量根冠比LPTC而言，T6、83、1021最大，T16、T22、T23最小；就磷吸收效率LPTC而言，T17、T23、T22最大，T7、T14、83最小；就磷利用效率LPTC而言，83、T7、T14最大，T23、T17、1021最小。即单独使用这几个评价指标对不同辣椒品种的排序结果并不完全一致。因此，若单独使用这几个指标来代替辣椒的耐低磷性，可能会得出具有误差甚至矛盾的结果。

表3 辣椒各品种磷及生物量分配利用LPTC特征

2.3 基于主成分分析的耐低磷特征评价

2.3.1 基于各性状耐低磷系数的主成分分析 15个单项性状的耐低磷系数(Xn)间存在不同程度的相关性，使得它们所提供的信息发生重叠。而常用的几个生物量分配利用指标的耐低磷系数(Yn)能涵盖的原始性状信息有限，可能遗漏某些耐低磷性状的关键信息。故需要使用一定的方法来压缩信息，本研究通过使用PCA的方法结合各单项性状耐低磷指数(Xn)的结果提取主成分，生成新的综合指标。

表4列出了利用SPSS软件对各性状的耐低磷系数进行主成分分析的结果。根据耐低磷系数公式(3)对各品种农艺性状测量值进行了标准化，消除了原始数据量级的差异，使得各个指标间具有可比性。前4个主成分累积贡献率达86.37 %，其贡献率分别为36.39 %、26.66 %、15.38 %和7.93 %，说明前4个主成分基本上反映了15个指标的信息。将前4个主成分分别定义为第1至第4个综合指标，这样就把原来15个具有相互关联的单项指标转换为4个新的相互独立的综合指标，它们对应的特征向量为：

表4 各性状耐低磷系数的主成分构成矩阵

第一主成分：Z1=0.045X1+0.333X2+0.555X3+0.567X4+0.540X5+0.571X6-0.199X7+0.317X8+0.581X9+0.863X10+0.863X11+0.581X12+0.89X13+0.708X14+0.709X15;

第二主成分：Z2=-0.034X1+0.785X2+0.738X3+0.339X4+0.645X5+0.330X6+0.608X7+0.843X8-0.645X9-0.445X10-0.445X11+0.229X12-0.224X13-0.024X14-0.451X15;

第三主成分：Z3=0.820X1+0.445X2+0.026X3-0.628X4+0.007X5-0.663X6+0.464X7+0.235X8+0.176X9+0.209X10+0.209X11+0.087X12+0.193X13-0.369X14+0.176X15;

第四主成分：Z4=-0.178X1+0.115X2+0.083X3-0.044X4+0.095X5-0.054X6+0.292X7+0.134X8+0.409X9-0.053X10-0.053X11-0.724X12-0.300X13+0.345X14+0.340X15。

在第1主成分中10、11、13、14、15项的系数较大，分别代表根系投影面积、根系表面积、根体积、根尖数、分支数，故第一主成分大致可概括为根系性状。在第2主成分的表达式中，第2、3、5、7、8、9项的系数较大，分别代茎干重、叶干重、茎磷百分含量、高、叶面积、根长，故第2主成分可概括为生物量及磷含量特性；在第3主成分的表达式中，第1、4、6项的系数较大，代表根干重、根磷百分含量、叶磷百分含量，故第3主成分可概括为生物量及磷含量特性；在第4主成分的表达式中，第12项的系数大，远远超过其他指标的影响，代表了根系平均直径。综合分析上述结果表明，主成分分析将原有的指标进行了综合压缩，降低了冗余，比单一指标更合理，以上4个主成分可作为辣椒耐低磷的主要综合鉴定指标。

2.3.2 基于综合耐低磷得分(D)的耐低磷特征评价 根据公式(5)求出每个品种所有综合指标的隶属函数值U和和各品种辣椒的D值，以进一步综合评价其耐低磷能力(表5)。由表5可知，每个品种所有综合指标的隶属函数值不尽相同。例如，对于同一综合指标如Z1而言，在低磷胁迫条件下，T10的U1值最大(1.000)，说明T10在Z1这一综合指标上表现的耐低磷特性最强；T12的U1值最小(0)，T6、T7的U1值较小，说明T6、T7在Z1这一综合指标上表现为耐低磷特性较弱。根据4个综合指标贡献率的大小(0.364、0.266、0.154、0.079)和公式(5)求出权重，分别为0.421、0.309、0.178、0.0925。

表5 各综合指标Z(x)、综合指标隶属函数U(x)及综合耐低磷得分D

根据公式(5)计算出各品种的综合评价耐低磷能力D值，通过D值可对各品种辣椒品种耐低磷特性进行强弱排序。参考周广生、郑金凤[11, 24]的划分标准，选择D值所在的区间>0.65、0.45～0.65和<0.45，将各品种划分为较强耐低磷、中度耐低磷和较弱耐低磷3种。其中较强耐低磷包含T17、T23、T16、T8、T10、T20、T22共7个品种，中度耐低磷包含T15、T5、T4、T14、T2共5个品种，较弱耐低磷包括T3、T9、T13、1021、T1、T6、T12、T11、T7、83共10个品种。

2.3.3 基于综合指标Z(x)排序的磷响应类型划分 基于Canoco5.0软件根据4个综合指标Z1～Z4对辣椒22个品种分别进行了排序分析，以探索不同辣椒品种的异同及它们之间的关系。分析结果以二维平面图的形式展示了二者之间的对应关系。图2中的圆点代表22个辣椒品种，排序图中矢量线表示各个主成分，圆点之间的距离越近代表各辣椒品种所涉及的各综合指标特征越为类似。圆点(代表某一辣椒品种)在某一矢量线段(代表各综合指标)上的投影离原点的距离越远，代表该品种某一综合性状的得分值与所有品种该性状的平均值的差异越大。投影位于矢量线段的正方向上，代表该品种的得分高于平均值，若位于矢量线段的延长线上，代表得分低于平均值。根据辣椒品种在排序图上所分布的位置与各个主成分之间的关系，可大致将其划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个类型。鉴于Z1和Z4主要代表根系特征，Z2和Z3主要代表生物量和磷吸收特征，类型的划分可归纳为根系敏感与否和磷吸收累积的高效与否。类型Ⅰ为根系敏感磷高效型，包括T17、T22、T23、1021；类型Ⅱ为根系钝感磷高效型，包括T2、T6、T7、T12、T16、T20；类型Ⅲ为根系钝感磷低效型，包括T1、T5、T9、T11、T13、83；类型Ⅳ为根系敏感磷低效型，包括T3、T4、T8、T10、T14、T15。

图2 基于排序分析的品种距离特征Fig.2 Distance relations of peppers based on rank analysis

3 讨 论

植物耐低磷性是受多因素、多机制共同作用的复杂数量性状[25-27]。不同辣椒品种耐低磷机制不同，不同指标的结果仅能反映其某一方面的适应性特征。前人常用干重根冠比，磷含量根冠比、磷吸收效率、利用效率等由2～3个性状指标合成的指标表征植物对逆境环境的耐受性。这几个指标虽包含了部分生物量和磷含量信息，但缺乏叶面积、根系分布特征等信息，可能遗漏了部分重要结果，故而造成评价结果的异质性及片面性。而使用多个指标来筛选大量辣椒种质苗期的耐低磷性虽更加全面，但可能存在信息重叠。故为了准确有效评价辣椒耐低磷特征，本研究借助主成分分析把15个形态指标转化为4个综合指标，第1主成分可归结为根系性状，第2、3主成分为生物量及磷含量特性，第4主成分的可归结为根系直径。将原有的指标进行了综合压缩，降低了冗余，比单一指标更合理，可作为辣椒耐低磷鉴定的基础。但与由2～3个性状合成的指标相比，本研究涉及的指标较多，后续研究中为能更简便地进行综合评价，可选取每个主成分中得分较高的性状，例如根体积、根系表面积、根干重、根磷百分含量、根系平均直径、叶面积及叶干重等进行测定和评价。

本研究在主成分分析基础上使用基于综合指标Z(x)的排序分析与基于综合耐低磷得分(D)这两种方法评价了辣椒的耐低磷特征，两种综合评价方法均基于主成分分析，但所代表的侧重点有所不同。使用综合耐低磷得分(D)能更加直观的获取耐低磷排序信息，从而可按照得分划分辣椒耐低磷能力；而基于综合指标Z(x)生成的排序图所获取的信息更为丰富，除了能按照距离远近对品种进行直观聚类外，还能获得不同品种与主成分之间的相关信息，并判定主成分代表的性状对耐低磷特征的影响，从而划分品种耐低磷的类型。这2种方法的评价结果可互为补充和参考。

植物磷效率的相对重要性因不同植物种类或基因型而异[28]。在低磷供应条件下，磷高效基因型辣椒具有更高的环境适应能力。本研究结果表明，T17、T23、T16、T8、T10、T20、T22等品种综合耐低磷得分较高，在磷缺乏区域可选用这些耐低磷品种以提高养分利用率，从而减少肥料用量，保护生态环境；T3、T9、T13、1021、T1、T6、T12、T11、T7、83等品种耐低磷的特性较弱，不适宜在低磷地区种植。本试验过程中采用水培试验对耐低磷品种进行评价和筛选，和实际土壤中的磷固定吸收释放过程存在差异，故在指导实际生产前还需进一步通过大田或土培试验验证。

比较综合指标Z(x)的排序分析与基于综合耐低磷得分(D)的结果发现，综合耐低磷得分D评价出的耐低磷特性较强的品种中T17、T23、T22属于根系敏感型，而T16、T20为根系钝感型；综合耐低磷得分D评价出的耐低磷特性较弱的品种中仅有T3属于根系敏感型，T9、T1、T11、83为根系钝感型。这些结果表明，具有耐低磷特征的品种往往根系更为敏感，但根系敏感与否的响应特征并不能完全代表其对逆境的耐性特征。

4 结 论

本研究通过对22个辣椒品种的15个性状耐低磷的主成分分析，将原来相互关联的指标转换成了4个独立的综合指标。通过计算各品种的综合评价值(D)将供试辣椒品种分成耐低磷能力有差异的3类，其中较弱耐低磷10个、中度耐低磷5个、较强耐低磷7个。基于综合指标Z(x)的排序分析，可将供试辣椒划分为根系敏感磷高效型、根系钝感磷高效型、根系钝感磷低效型及根系敏感磷低效型共4种类型。采用本试验建立的辣椒苗期耐低磷筛选评价体系与方法，可实现在早期对辣椒耐低磷性状进行大批量初步评价，为辣椒耐低磷种质资源的发掘与利用及其他同类研究提供技术支持。