炎症微环境对人牙髓细胞向成牙本质细胞分化的影响

唐杰

炎症微环境对人牙髓细胞向成牙本质细胞分化的影响

唐杰

（合肥市口腔医院，安徽 合肥 230001）

通过体外培养人牙髓细胞，研究炎症微环境对人牙髓细胞向成牙本质细胞分化的影响。用体外酶消化结合组织块法培养人牙髓细胞。将细胞分为对照组和实验组，对照组为正常培养液培养的人牙髓细胞，实验组为含TNF-α终浓度分别为10 ng/ML培养液培养的人牙髓细胞，分别将两组细胞进行成骨诱导；Real time PCR检测成骨诱导后两组细胞牙本质基质蛋白1（DMP1）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨钙蛋白（OCN）的表达情况。酶消化加组织块法培养出来的牙髓细胞大多呈长梭形，胞浆丰满；Real time PCR检测结果表明，与对照组相比，成骨诱导后，TNF-α刺激下的牙髓细胞DMP1、DSPP、OCN的mRNA表达量明显降低，差异有统计学意义。实验发现，炎症微环境可以导致牙髓细胞向成牙本质细胞分化能力减弱，从而影响牙体组织的健康。

炎症微环境；人牙髓细胞，成牙本质细胞；分化影响

人牙髓干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，具有较强的增殖和分化能力，在一定条件下可分化为成软骨细胞、成牙本质细胞、成骨细胞以及脂肪细胞[1-2]，因此，牙髓干细胞作为一种牙髓再生的种子细胞[3]，对维系牙齿的健康有着重要的作用。炎性微环境是牙髓疾病最常发生的一种病理状态，严重影响着牙齿的健康，本实验对炎性微环境下人牙髓细胞向成牙本质细胞的分化过程进行了研究，探索了该分化过程中相关基因表达发生的改变。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、实验仪器

主要试剂、实验仪器如表1所示。

表1 主要试剂、实验仪器

名称公司生产地 PBSHyCIoneUSA α-MEM培养基GibcoUSA 胎牛血清四季青杭州 双抗GibcoUSA Ⅰ型胶原酶SolarbioUSA 胰蛋白酶GibcoUSA TNF-αBioVisionUSA TRIzol裂解液AmbionCA 逆转录试剂盒TIANGEN北京 RT-PCR试剂盒TIANGEN北京 二氧化碳培养箱ThermoUSA 超净培养台苏州设备净化有限公司苏州 倒置相差显微镜OLYMPUSJapan

1.2 实验方法

1.2.1 取材

牙髓组织取材于合肥市口腔医院口腔颌面外科门诊因正畸拔除或第三磨牙拔除的患者，取材前征得患者及家属同意，要求患者无全身系统性疾病，无牙体牙髓疾病及牙周疾病，患者年龄14～20岁。

1.2.2 细胞培养

酶消化结合组织块法培养牙髓细胞，用无菌裂钻劈开牙体硬组织，取出新鲜的牙髓组织放在预冷的含有双抗的比例为1∶100的PBS中，反复冲洗干净后转移到无菌培养皿中用手术刀轻轻分割牙髓组织。1 000 r/min离心5 min。弃上清后，加入含3 mg/ml的I型胶原酶1 ml，37.5 ℃每隔5 min振荡，消化70 min，加入少量胎牛血清终止消化。离心后弃上清，加入2 ml α-MEM培养液（含10%胎牛血清），将其置于二氧化碳培养箱（5 %CO2，37 ℃恒温）中孵育，每隔一天换液。待细胞汇集80%后传代培养。

1.3 实验分组

将牙髓细胞分为正常组和实验组，正常组细胞用含有5%胎牛血清的α-MEM培养液培养，实验组细胞用培养液含终浓度为10 ng/ML的TNF-α培养，并对两组细胞分别进行成骨诱导。

1.4 Real time PCR检测两组细胞成骨诱导前后DMP1、DSPP、OCN的表达

将正常组和对照组的牙髓细胞用TRIzol裂解，提取RNA，经逆转录为cDNA。引物设计由上海生工生物有限公司设计合成，引物序列如表2所示。

1.5 统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行统计分析，各实验数据均采用均数±标准差（±）表示，组间差异单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。＜0.05，差异有统计学意义。

表2 引物序列

基因上游引物下游引物 DMP15’AGTGCCCAAGATACCACCAG3’ 5’CATTCCCTCATCGTCCAACT3’ DSPP5’TGGCGATGCAGGTCACAAT3’5’CCATTCCCACTAGGACTCCCA3’ OCN5’AGCCCATTAGTGCTTGTAAAGG 3’5’CCCTCCTGCTTGGACACAAAG3’ β-actin5’GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG3’5’CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG3’

2 实验结果

2.1 人牙髓细胞的培养

用酶消化+组织块法培养原代细胞，3 d左右组织块周围有牙髓细胞贴壁爬出，原代培养的牙髓细胞如图1所示。待细胞长到80%进行传代，实验选用细胞状态良好的第三代细胞作为研究对象，第三代牙髓细胞如图2所示。

图1 原代培养的牙髓细胞

图2 第三代牙髓细胞

2.2 成骨诱导后，炎症微环境下牙髓细胞成牙本质相关基因表达情况

分别对正常培养液培养下的人牙髓细胞与TNF-α刺激下的人牙髓细胞进行成骨诱导，诱导3周后Real time PCR检测各组细胞牙本质基质蛋白1（DMP1）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨钙蛋白（OCN）的表达情况，结果显示TNF-α刺激组DMP1、DSPP、OCN的表达明显降低。成骨诱导后刺激组DMP1表达明显下降如图3所示，成骨诱导后刺激组DSPP表达明显下降如图4所示，成骨诱导后刺激组OCN表达明显下降如图5所示，图3、图4、图5差异有统计学意义（＜0.05）。

3 讨论

牙髓干细胞是从牙髓细胞中分离出来的一种具有干细胞特性的细胞，其作为种子细胞，在牙髓再生的过程中发挥着重要的作用。本实验虽然提取的是牙髓细胞，但其骨向分化能力显示其中包含了牙髓干细胞，炎症微环境一方面影响了牙髓细胞的活力，另一方面在很大程度上影响了牙髓干细胞分化的功能。本实验研究了炎症状态下人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中相关基因表达的情况，发现成牙本质相关基因表达量的改变，从而证明了炎症微环境会导致人牙髓干细胞成人本质分化能力减弱。

牙本质基质蛋白1（DMP1）是牙发育过程中一种重要的非胶原基质蛋白，在骨细胞中特异表达，对牙本质的形成和矿化起着重要作用，有学者研究表明[4]在分泌过程中，全长的前体Dmp1被裂解成N-和C-末端片段。C-末端Dmp1磷酸化，成为一个高度负电荷的结构域，可能通过吸收钙离子和影响随后的矿物质沉积来帮助骨矿化，DMP1在牙胚发育过程中具有诱导成牙本质细胞分化和分泌，启动牙本质矿化和充当细胞间信号分子等作用[5]。牙本质涎磷蛋白（DSPP）是牙本质矿化研究领域中的热点，研究表明DSPP基因突变与牙本质发育不全密切相关，并伴有明显的牙齿龋坏[6-7]，有学者在小鼠中敲除了DSPP基因，研究发现小鼠的牙本质和骨矿化缺陷[8]。本实验中通过检测DMP1和DSPP这两种与牙本质形成密切相关的两个基因，同时检测了与骨形成密不可分的基因OCN，在一定程度上反映了牙髓细胞向成牙本质细胞分化的能力，而炎症微环境影响了该能力，阻碍了牙髓细胞向成牙本质细胞分化。

图3 成骨诱导后刺激组DMP1表达明显下降

图4 成骨诱导后刺激组DSPP表达明显下降

图5 成骨诱导后刺激组OCN表达明显下降

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R780.2

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.02.011

2095－6835（2020）02－0040－02

唐杰（1988—），男，安徽肥西人，研究生，住院医师，研究方向为MTA、iRoot BP、dycal在成熟恒牙深龋意外露髓、外伤露髓中临床疗效评价。

〔编辑：严丽琴〕