自身免疫病病人外周血NK细胞检测的意义

陈 琳,吕 程,孟天犁,姜国平,李慧颖,吕英春,江 涛,孔令环

(吉林省人民医院 风湿免疫科，吉林 长春130021)

自身免疫病包括系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、类风湿关节炎、风湿热、多发性肌炎/皮肌炎等。是风湿性疾病中的一组疾病。其特点为临床表现多种多样，多器官受累，重要器官受累可危及生命。应用皮质醇、类固醇和免疫抑制剂治疗有效。病因未明，与遗传、免疫、感染等因素有关。以SLE为例，大量研究[1]表明，多种因素通过影响细胞免疫功能紊乱而致病，SLE存在T、B细胞功能紊乱，但SLE患者外周血淋巴细胞亚群改变与疾病的活动性之间的关系尚有争论，多数学者认为T淋巴细胞功能的紊乱引起B淋巴细胞的高度活化而产生多种自身抗体是本病发生和发展主要因素。

自然杀伤(natural killer，NK)细胞在机体正常的免疫、防御机制中起重要作用。本研究采用流式细胞术检测外周血NK细胞数量及其胞膜活化性受体NKG2D(CD314)和抑制性受体NKG2A(CD159)以及穿孔素、颗粒酶-β的表达，探讨NK细胞在自身免疫病发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取我院2018年1月-12月自身免疫病住院病人29例。其中女14例，男15例。年龄23-84岁。类风湿关节炎8例，强直性脊柱炎4例，银屑病关节炎6例，炎症性肠病关节炎1例，系统性红斑狼疮2例，风湿性多肌痛1例，结缔组织病1例，ANCA相关性血管炎4例，干燥综合征2例。对照组18例，均为健康体检者，男10例，女8例，年龄31-53岁。

1.2 试剂、仪器和方法

1.2.1购买美国Beckman Coulter 公司单抗 鼠抗人CD159( (NKG2A)- PE、CD314(NKG2D)-FITC,CD3-ECD、CD16-PC5、CD56-PC5，颗粒酶granzymeβ-PE,穿孔素 perforin-FITC，及溶血剂、破膜剂。

1.2.2流式细胞仪为美国贝克曼公司的多参数EPICS XL型流式细胞仪，应用EXPO32ADCXL4 Color 软件分析，在FSC-SSC散点图上选定淋巴细胞群，结果以百分率表示。

1.2.3流式细胞术分析方法 采用微量全血直接免疫荧光技术标记NK细胞。检测胞模蛋白： Falcom管加入抗体CD16- PC5、CD56- PC5、CD3-ECD各10 μl、NKG2A- PE 20 μl、NKG2D-FITC 5 μl用于标记NK细胞和NKG2A、NKG2D；再加100 μl外周血，充分混匀。孵育，加入溶血剂500 μl，混匀，室温避光10 min，1 500 r/min离心5min,弃上清，加500 μl PBS，上机检测。检测胞质蛋白：Falcom管加入抗体CD16- PC5、CD56- PC5、 CD3-ECD各10 μl，再加100 μl外周血，室温避光孵育15 min,加入A液50 μl，避光15 min，加入PBS液1 ml洗1次，离心弃上清，加入50 μl B液，依次加入granzyme β- PE、 perforin-FITC单抗各5 μl，4℃避光孵育15 min，加PBS液1 ml洗涤2遍，加500 ul PBS，上机检测。

1.3 统计学

2 结果

2.1 自身免疫病病人外周血NK细胞占淋巴细胞百分比

自身免疫病病人外周血NK(CD3-CD16+CD56+)细胞在治疗前和治疗后均低于正常对照组，但无明显统计学差异；治疗前外周血NK(CD3-CD16+CD56+)细胞在与治疗后相比，无明显统计学差异，见表1。

2.2 自身免疫病病人NK细胞膜活化性受体、抑制性受体表达

自身免疫病病人NK细胞膜活化性受体NKG2D(CD314)的表达在治疗前和治疗后均低于正常对照组(P≤0.001)；治疗后NK细胞膜活化性受体NKG2D(CD314)的表达较治疗前上升，但无明显统计学差异，见表1。

自身免疫病病人NK细胞膜抑制性受体NKG2A(CD159)的表达在治疗前和治疗后与正常对照组相比，均无明显统计学差异；治疗前NK细胞膜抑制性受体NKG2A(CD159)的表达与治疗后相比，无明显统计学差异，见表1。

2.3 自身免疫病病人NK细胞穿孔素、颗粒酶-β的表达

自身免疫病病人NK细胞穿孔素的表达在治疗前和治疗后与正常对照组相比，均无明显统计学差异；治疗前NK细胞穿孔素的表达与治疗后相比，无明显统计学差异,见表1。

自身免疫病病人在治疗前和治疗后NK细胞颗粒酶-β的表达与正常对照组相比，均显著减低(P<0.05)；但治疗前NK细胞颗粒酶-β的表达与治疗后相比，无明显统计学差异，见表1。

表1 外周血NK细胞及其表面受体的表达

与对照组相比较；※P<0.05 治疗后与治疗前相比较，&P<0.05

3 讨论

免疫功能失调是自身免疫性疾病发病机制的关键环节。(CD3-CD16+CD56+)NK细胞是天然免疫系统的重要组成部分，在抗病毒感染免疫、肿瘤免疫、移植排斥反应及免疫调节中起十分重要的作用[2]。

NK细胞是来源于骨髓的一类淋巴细胞，因胞内含有大量嗜天青颗粒，也被称为大颗粒淋巴细胞(large granular lymphocyte，LGL)。NK细胞广泛存在于骨髓、肝、子宫、脾、肺、次级淋巴组织(secondary lymphoid tissue，SLT)、黏膜相关淋巴组织(mucosa-associated lymphoid tissue，MALT)及胸腺，通常占人体外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC )的5%-15%，仅次于T、B细胞之后[3]。作为天然免疫的重要组成部分，NK细胞是最早到达炎症位点的细胞之一，起到免疫监视作用，主要通过监视细胞膜表面的MHC class I分子的含量来识别发生溶解改变或是受到病毒感染的自体细胞，当靶细胞膜表面低表达MHC class I分子时，NK细胞的抑制因子降低，NK细胞活化，释放大量细胞毒性颗粒(如：颗粒酶，穿孔素)以及炎性细胞因子(如TNF、IFN-γ)，导致靶细胞死亡。同时在适应性免疫中，NK细胞也参与清除自身反应性T、B细胞[4]。

NK细胞为继T细胞、B细胞的第3类淋巴细胞，在天然免疫和获得性免疫中均发挥重要作用[5，6，7]。NK细胞表面受体对于NK细胞发挥自身功能活性起到重要作用，其中NKG2家族是近年来研究关注较多及研究较深入的一类受体，包括NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F和NKG2H 等[8]。根据功能可分为抑制性受体和活化性受体2大类。其中NKG2A是NKG2家族中唯一的抑制性受体，可以识别自身MHC class I，进而阻止NK细胞的活性[9]。人NKG2D是NK细胞表面的活化性受体，能与MHC class I链相关分子A和B结合，NKG2D受体通常不表达于正常细胞上，但是可以在肿瘤细胞或被感染的细胞中过表达。在正常情况下，NKG2A，NKG2的表达水平处于平衡状态，共同调节NK细胞的活性。抑制性NK细胞受体的自身抗体和NKG2A的存在可以极度提升 NK 细胞功能导致体内自身抗体水平增高最终刺激自身免疫反应[10，11]。关于RA患者外周血中NK细胞表面受体的表达水平，研究不一致。Vastert等[12]发现RA患者外周血中NKG2A表达水平低于健康人；另有研究表明RA患者NKG2A+NK细胞的表达水平升高，而NKG2D的表达降低[5]。本研究中，NKG2D的表达降低(P≤0.001)，NKG2A的表达较正常对照组虽然无明显统计学差异，但表达高于正常组，可能与样本量不足有关。NKG2D的表达降低，导致NK细胞活化功能受到抑制，不能有效发挥堆免疫效应细胞的杀伤作用，从而导致自身免疫病的发生。

NK细胞通过消除活化的免疫效应细胞执行其免疫调节过程，关于此机制，Jacobs等[13]已有研究证实活化的NK细胞可以通过分泌穿孔素，颗粒酶-β等，参与细胞凋亡通路进一步消除机体活化的效应细胞，例如CD4+T细胞等。穿孔素又称孔道形成蛋白，是NK细胞核细胞毒性T细胞特有的具有杀伤功能的蛋白质。杀伤细胞与靶细胞接触，杀伤细胞的胞浆颗粒即向两个细胞接触部位移动，然后被释放“分泌”到细胞外。穿孔素存在于这种颗粒中，并在Ca2+存在下在靶细胞膜上形成穿膜孔道，导致靶细胞溶解[14]。本研究表明，自身免疫病病人NK细胞颗粒酶-β的表达与正常人相比，显著降低。这与Vastert等[12]关于幼年特发性关节炎患者的研究结果一致。然而相反的是，Ashish 等的研究结果显示，RA患者外周血中NK 细胞表达的颗粒酶-β水平是升高的。自身免疫病病人NK细胞穿孔素的表达与正常人相比，无明显差异。因此，颗粒酶、穿孔素在风湿免疫病的作用机制需要进一步研究。

自身免疫病病人外周血NK细胞占淋巴细胞百分比、NK细胞膜活化性受体、抑制性受体表达、NK细胞穿孔素、颗粒酶-β的表达在治疗前后无明显差异，考虑免疫抑制剂对NK细胞影响较小。

综上，外周血NK细胞的膜活化性受体NKG2D和颗粒酶-β表达减少可能与自身免疫病的发生、发展有关。可进一步研究NK细胞在自身免疫病的发病和治疗作用，寻找治疗自身免疫病的新方法。