清火抗毒丸的薄层色谱鉴别研究

赵 颖 李海欧 张旭东 顾艳丽* 杨彩静谢宇鑫 金兆宇（.内蒙古医科大学 呼和浩特 000；.巴彦淖尔市残联眼科医院 巴彦淖尔 05000）

清火抗毒丸是由黄芩、栀子、连翘、金银花等几味药组成，具有清热解毒、泻火、降压、抗炎等功效，适用于细菌性、病毒性结膜炎、角膜炎、睑板腺感染及化脓性泪腺炎等眼睑及眼眶炎症疾病的治疗。为提高药品的质量控制要求，采用薄层色谱法鉴别清火抗毒丸中的栀子、黄芩，该方法操作简便，快捷，结果可靠，为其他制剂中栀子、黄芩的鉴别提供依据。

1 仪器与试药

真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；HH-4水浴锅（常州荣华仪器制造有限公司）；SB25-12DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工有限公司）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；栀子对照药材（中国食品药品检定研究院），批号：120986-201610；栀子苷（中国食品药品检定研究院），批号：110749-201718；黄芩苷（中国食品药品检定研究院），批号：110513-201711；清火抗毒丸（巴彦淖尔市残联眼科医院提供，批号 20180720，20180722，20180724），所用药材购自天津中药饮片厂，经内蒙古医科大学教授渠弼鉴定；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲酸、硫酸、乙醚、三氯甲烷、冰醋酸、甲苯、盐酸等均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 黄芩薄层色谱鉴别：取本品粉末2g，加入乙醚溶液30mL，通过超声处理30min后，滤过，弃去乙醚溶液，挥干药渣中乙醚溶剂，加入甲醇30mL，再次超声处理30min，将其滤过，把滤液蒸干，将20mL水加入残渣使残渣溶解，用盐酸试剂调节溶液pH值至1～2，用乙酸乙酯溶液振摇提取2次，每次20mL，将两次的乙酸乙酯液体合并，并蒸干，最后加入3mL的甲醇溶液使残渣溶解。按照同样的方法和处方比例制备缺少黄芩的阴性对照溶液。再称取适量的黄芩苷对照品，加入甲醇制成每1mL甲醇中含1mg黄芩苷对照品的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，将上面所说的两种溶液各吸取0.5μL，分别点在同一聚酰胺薄膜上面，用甲苯-丙酮-甲醇-冰醋酸（8∶1∶1∶1.2）作为展开剂，将展开剂放入展开缸中预饱和30min，然后展开，小心取出，将薄层板晾干，用2%的三氯化铁乙醇溶液喷到薄层板上。比较供试品色谱与对照品色谱中斑点的位置和颜色，二者斑点均相同，且在阴性对照的色谱中与对照品色谱相同的位置上没有干扰，见图1-A。

2.2 栀子薄层色谱法鉴别：称取本品2g，研细后，加入乙醚溶液10mL，通过超声处理20min后，弃去乙醚溶液，药渣挥干，加入乙酸乙酯溶液20mL，经过加热回流1h，取出，然后放冷，将其滤过，并将滤液蒸干，加入2mL的甲醇溶液使残渣溶解，滤过，滤液为供试品溶液。处方中除去栀子，根据处方比例按照上述方法制成阴性对照溶液。另外称取0.5g的栀子对照药材，按照相同的方法配制成对照品药材溶液。再称取栀子苷的对照品，加入乙醇制成每1mL乙醇中含4mg的对照品溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法（通则0502）进行试验，精密吸取以上四种溶液，用同一硅胶G薄层板，点样量皆为2μL，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水（10∶4∶1∶1）为展开剂，在展开缸中展开后，小心取出，晾干后，在薄层板上喷10%的硫酸乙醇溶液，在105℃的条件下加热到薄层板上斑点显色清晰。比较供试品与对照品的色谱，发现斑点的位置及颜色都相同，阴性对照无干扰，见图1-B。

3 讨论

3.1 黄芩的鉴别

3.1.1 提取溶剂及方法比较：取效果，黄芩的主要成分为黄芩苷，方法一经乙醇超声提取、方法二先经乙醚萃取，弃去乙醚液，以除去干扰成分，再用甲醇超声处理本品，提取黄芩苷，酸化后以乙酸乙酯萃取。结果表明后者薄层色谱中斑点清晰，阴性对照无干扰。

3.1.2 薄层板比较：根据药典方法，比较了展开剂在硅胶G薄层板和聚酰胺薄膜上的展开效果，聚酰胺薄膜具有较好的亲水和亲脂双重性能，适用于黄酮类成分的中药分离，黄芩苷属于黄酮类化合物[1]，在聚酰胺薄膜上展开，斑点清晰，阴性无干扰，因此选择聚酰胺薄膜展开。

3.1.3 展开剂比较：此次考察以下展开条件，甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）（Ⅰ）[2]，甲苯-丙酮-甲醇-冰醋酸（8∶1∶1∶1）（Ⅱ）[3]，甲苯-丙酮-甲醇-冰醋酸（8∶1∶1∶1.2）（Ⅲ），与药典展开系统（Ⅰ）比较，（Ⅰ）展开后斑点较集中，极性较小，使各成分不能分开，（Ⅱ）展开后，斑点清晰但有少许拖尾现象，（Ⅲ）展开后斑点圆整且清晰，阴性对照没有干扰，在同一种展开系统中，极性愈大，对化合物的洗脱能力越大，即在薄层板上把主要斑点推得越远，Rf值也越大。药典中的展开剂极性较小，在实验中发现丙酮的极性较乙酸乙酯大，冰醋酸的极性较甲酸大，所以换用极性较大的展开系统（Ⅲ）进行层析，发现在跑板中Rf值适中，不拖尾，所以选用展开系统（Ⅲ），用冰醋酸替换甲酸，丙酮替换乙酸乙酯。综上，实验筛选出的理想展开系统为甲苯-丙酮-甲醇-冰醋酸（8∶1∶1∶1.2）。实验同时对展开环境的温度和相对湿度进行了考察，结果温度在18℃～25℃，相对湿度在25%～50%，薄层色谱中斑点的分离度较好。展开系统确定后进行了稳定性实验和重复性实验，稳定性实验的结果说明供试品以及对照品溶液在6h进行薄层色谱鉴别，色谱中主要斑点的分离度很好。重复性实验结果表明，展开系统展开的重复性方法良好。中药分析中，三氯化铁的乙醇溶液广泛应用于黄酮类成分定性、定量分析的显色剂，能与黄芩苷成分显绿色，因此，可用于实验中黄芩的薄层层析鉴别。

3.2 栀子的鉴别

3.2.1 提取溶剂及方法比较：比较了三种溶剂提取的效果，50%甲醇超声提取、乙醚除杂后水饱和的正丁醇提取、经乙醚萃取，弃去乙醚液，除去干扰成分，再用乙酸乙酯回流提取。结果表明后者薄层色谱中斑点圆整清晰，杂质斑点更少，无拖尾现象，Rf值适中，选择该方法提取。

3.2.2 展开剂选择：实验中考察了以下展开系统，乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（10∶7∶2∶0.5）（Ⅰ）[4]，乙酸乙酯–丙酮-甲酸-水（5∶5∶1∶1）（Ⅱ）[5]，正丁醇-三氯甲烷-甲醇-水（4∶4∶1∶0.2）（Ⅲ）[6]，三氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水（10∶4∶1∶1）（Ⅳ）[7]。展开剂（Ⅰ）和（Ⅱ）展开后，斑点不清晰，而且阴性有干扰。（Ⅲ）展开后有清晰的斑点，但是背景颜色较深，选择（Ⅳ）展开，斑点较圆且清晰，阴性对照无干扰。因此选择展开剂（Ⅳ）。实验条件确定后进行了耐用性考察，考察了点样量、展开距离、预饱和时间、显色温度对实验的影响，结果表明，点样量为1μL，展开距离为6cm，预饱和时间为20min，显色温度为105℃时，斑点显色清晰，分离度好。采用10%硫酸乙醇溶液显色，显色后在日光下观察发现显色灵敏，杂质斑点较少，主斑点清晰，较为规则，分离度及重现性较好。在紫外灯（365nm）下检视，发现阴性对照中的杂质荧光有干扰，因此，选择在日光下检视。

4 结论

清火抗毒丸含有药材较多，成分十分复杂，在本实验中，通过有效的前处理，除去干扰杂质，使薄层色谱分离效果好，并且设置阴性对照，用三批样品实验确证，该方法专属性强，栀子、黄芩中有效成分斑点清晰，易于判断，重现性好，能反映该制剂的质量，可用于该制剂的质量控制。