泗阳县水生动物致病性病原菌对药物感受性试验及结果分析

陈瑜，李勇，李晓丽

（1.泗阳县三庄乡农业经济技术服务中心，江苏 泗阳 223700；2.泗阳县水产技术指导站，江苏 泗阳 223700）

泗阳县地处洪泽湖岸边，近年来内塘渔业放养密度、饲料投喂越来越大，呈数量型、规模型发展态势，结果虽提高了产量，却恶化了水质，导致病害频发，其耗水量、用药量倍增，给水产养殖造成极大风险。由此，倡导“提质增效、减量增收、绿色发展、保护资源”渔业方向。2018年4—11月，作者对泗阳县域内水产主要养殖品种进行了疫病监测，并对其感染致病性菌株形态、生理生化特征、药物敏感性试验等进行了研究，为区域内细菌性疾病的病原分析和防控提供科学数据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

来自泗阳县卢集镇、穿城镇、三庄乡、史集街道办、城厢街道办、爱园镇等渔场的多个发病养殖塘口，采集活力差、表皮充血、肛门红肿、黑头、溜边等濒临死亡的水产样品。

营养肉汤、营养琼脂、TCBS琼脂、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂购于北京陆桥。肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）（API 20E）购于上海某公司，动物用药敏分析试剂板购于南京某公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离纯化 样品先用酒精棉擦拭，用灭菌的镊子和剪刀取适量病变组织、内脏、血液、鳃等放于营养汤，置于28℃恒温培养箱中培养18～24 h。在无菌条件下，用灭菌的接种环取培养液划线接种于普通营养琼脂培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养18～24 h。观察菌落形态，并挑取可疑单个菌落划线接种在TCBS培养基和脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂培养基上，分别置于37℃和28℃恒温培养18～24 h。

1.2.2 API试剂条微生物鉴定 用灭菌吸管挑取单个菌落至0.85%的NaCl中制成菌液，将5 mL无菌水放进培养盒里，将试剂条放进培养盒内，将菌液接种充满小管或小管及小杯（CIT，VP和GEL），利用矿物油覆盖制定的生化孔（有划线的孔）、和，形成厌氧环境。盖上培养盒，于（36±2）℃孵育 18～24 h，同时做氧化酶试验构成第21个试验。孵育后根据判读表判断反应结果，参照生化谱手册，得到鉴定结果，同时参照NCCLs和CLSI标准对药物的敏感性及耐药性进行判断。

1.2.3 病原菌的药敏试验 该试验分别对30株致病性嗜水气单胞菌、3株副溶血弧菌和3株气味沙雷氏菌进行了抗菌素感受性试验。实验步骤：挑取纯化后的单个菌落于5 mL生理盐水中，制成0.5麦氏单位浓度的菌悬液制成A管；取2支10 mL的无菌生理盐水，打开任意一瓶，以无菌的方式向阴性对照孔分别加入200 uL的无菌生理盐水；从A管中吸取200 uL菌悬液加入到打开的10 mL无菌生理盐水中制成B管。将B管所有菌液倒入到经灭菌的V形槽中，再将另一支10 mL无菌生理盐水倒入V形槽中。混均后，利用微量移液器吸取V形槽中的菌液加入到药敏板所有试验孔中（阴性对照除外）200 μL；将加样好的药敏分析试剂板放入35℃的恒温培养箱中培养18～24 h，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，孔内液体浑浊为阳性（＋），孔内液体澄清为阴性（-），最低药物浓度即药物的最小抑菌浓度（MIC）。

2 试验结果

2.1 具体的采样地点、品种和数量

2018年4—11月在全县的13个养殖场塘口抽检76个样品，其中河蟹31个，草鱼29个，鲫鱼11个，小龙虾5个。如表1所示。

2.2 病原菌的分离及形态特征观察

分离的出的嗜水气单胞菌在基础培养基营养琼脂上为圆形、边缘整齐、表面光滑、湿润、微凸、微白色至浅米色菌落，在大部分脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板上，菌落周围出现明显的透明的溶蛋白圈；副溶血弧菌在TCBS上成圆形、半透明、表面光滑的绿色或蓝绿色菌落。革兰氏染色阴性（-）。

表1病原微生物检测采样品种和数量汇总表

2.3 API试剂条病原微生物鉴定结果

76个样品分离出60个菌株，阳性检测率78.95%。分别确定嗜水气单胞菌45株，阳性检出率的59.2%，副溶血弧菌3株，阳性检出率的3.95%，气味沙雷氏菌3株，阳性检出率的5.26%(表2)。还有未在表中列出的草鱼中检测出的土生拉乌尔菌、紫色色杆菌、脑膜脓毒性金黄杆菌各1株，河蟹中检出的阪崎肠杆菌、创伤弧菌、枸橼酸杆菌、布式柠檬酸杆菌、霍氏格里蒙菌各1株，共8株，阳性检测率10.5%。16株未知菌株。

表2常见的水产病原细菌阳性检测结果汇总表

2.4 菌株对药物感受性试验结果

30株致病性嗜水气单胞菌、3株副溶血弧菌和3株气味沙雷氏菌对8种抗菌药物的感受性测定结果分别如表 3、表 4、表 5、表 6、表 7、表 8所示。

表3各种抗菌药物对致病性嗜水气单胞菌最小抑菌浓度（MIC值）

表4 30株致病性嗜水气单胞菌对抗菌素感受性判定结果

表5各种抗菌药物对副溶血弧菌最小抑菌浓度（MIC值）

表6 3株副溶血弧菌对抗菌素感受性判定结果

表7各种抗菌药物对气味沙雷氏菌最小抑菌浓度（MIC值）

表8 3株气味沙雷氏菌对抗菌素感受性

3 讨论与分析

试验数据分析，采样分离到的的病原菌对不同抗菌素药物表现出了不同程度的感受性和耐药性。

30株嗜水气单胞菌对硫酸新霉素最敏感，敏感菌株率为100%，其次对氟苯尼考、乳酸环丙沙星、恩诺沙星和强力霉素敏感菌株率分别为96.7%、93.3%、90%和83.3%。但对红霉素最不敏感，耐药菌株率达93.3%，其次是甲砜霉素，耐药菌株率达83.3%。因此，建议在该区域内对嗜水气单胞菌引发的疫病可选硫酸新霉素、氟苯尼考、恩诺沙星和强力霉素。

3株副溶血弧菌均分离于河蟹肝胰腺中，说明副溶血弧菌主要感染河蟹，通过药物感受性试验结果来看，该菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、乳酸环丙沙星、盐酸土霉素和强力霉素都敏感，敏感率达100%。通过流行性病学调查分析，这与当地成蟹养殖过程中较少使用抗菌药物相关联，当地成蟹对大多数抗菌药物有较好的敏感性。而对甲砜霉素耐药菌株达100%，经过调查，这可能是由于当地十几家养蟹户曾从同一苗种场购买扣蟹，而该苗种场多次使用甲砜霉素有关。对红霉素的耐药菌株达66.7%，经调查，这些塘口都有次数不等地使用过含红霉素成分的蓝藻药杀蓝藻的经历，造成了菌株对红霉素产生耐药性，得引起相关部门足够重视。

在草鱼、龙虾和螃蟹中均分离出气味沙雷氏菌，该菌是一种广谱菌。油镜观测革兰氏染色阴性（-），菌体杆状。药物感受性试验得出，该菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、乳酸环丙沙星敏感菌株达100%，对红霉素不敏感，耐药菌株达100%，其次是甲砜霉素也不敏感，耐药菌株达66.7%。这可能也与使用过含红霉素成分的蓝藻药杀蓝藻的经历有关。

试验用30株致病性嗜水气单胞菌、3株副溶血弧菌和3株气味沙雷氏菌对8种抗菌药物进行敏感性试验，显示该区域养殖水产品对大多数抗菌药物均有较高敏感性，但也对极个别药物产生强耐药。此结论对精准选用抗菌药物具有一定的参考价值。