梁王茶叶及其速溶茶粉的化学成分分析和抗氧化研究

赵春燕，龚加顺，杨磊帮，王秋萍

（云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201）

梁王茶属（Nothopanax Miq.）系五加科（Araliaceae）的常绿、无刺灌木或乔木，全世界约有15 种，主要分布于大洋洲，我国仅有2 种，即掌叶梁王茶[Nothopanax delavayi（Franch.）Harms ex Diels，LWC]和异叶梁王茶[N.davidii（Franch.）Harms ex Diels][1]。梁王茶又称梁旺茶，山槟榔、良旺茶、树五加、白鸡骨头树等[2]。我国梁王茶野生资源主要集中在华中、西南、西北地区，多生长在海拔350 m～3 000 m，野外生存环境多数为山坡、沟谷和竹、林木下或灌木丛中及河边或路旁[1]。梁王茶是云南白族的药用植物，白语称作“构肌肝”（云龙、剑川）、“构肝丘”（洱源）、“武伙”（云龙，意译：回味、清凉）。药用全株，味甘、微苦、性凉，具清热解毒、活血舒筋、止渴、止咳、理气消食、止痛等功效。白族民间用于治咽喉痛、咳嗽、消化不良、蛔虫、月经不调、跌打损伤、肠炎、解烟毒，根用于风湿骨痛[2]。现代药理研究表明，掌叶梁王茶的根与茎具有较好的镇痛作用[3]。梁王茶的五环三萜物质具有抗癌抗肿瘤作用、免疫调节作用、消炎镇痛作用、抗病毒抑菌作用以及预防心脑血管疾病等作用[4]。

目前对梁王茶的研究主要集中在异叶梁王茶的根、树皮等部位的化学成分分析，对于掌叶梁王茶的研究极少。在我国掌叶梁王茶主要分布在云南、贵州、四川、湖南及湖北，尤其是云南海拔1 700 m～3 000 m山谷阔林、混交林或灌丛中[5]。云南省兰坪县是掌叶梁王茶生长的最适宜地区，当地有将其嫩叶入食的习俗。采摘梁王茶嫩叶，水洗沥干后，按照绿茶加工工艺，杀青、揉捻、晒干后制成梁王茶茶叶，冲泡后，其茶香扑鼻，汤色金黄清澈，茶汤过喉，圆润甘甜。

相关报道已对梁王茶不同部位的化学成分进行了鉴定。庾石山等从异叶梁王茶树皮中分离得到2 种五环三萜皂甙（异叶梁王茶甙III 和IV）、2 种新的三萜皂苷（异叶梁王茶苷Ⅶ和Ⅷ）、梁王茶苷Ⅱ、及5 种新化合物（异叶梁王茶甙Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ）[6-10]。洪化鹏等从异叶梁王茶干叶中分离得到2 种齐墩果烷型三萜及2 种三萜类化合物（3β-olean-12-ene-28，29-dioic acid和梁王素A）[11-12]。杨青等从掌叶梁王茶茎皮的70%乙醇提取物中分离得到11 个化合物，主要为糖苷、糖酯苷[13]。梁王茶新鲜植株有芳香气味，胡英杰等对掌叶梁王茶精油的化学成分进行了研究，其研究结果鉴定出梁王茶中有月桂烯、萜烯-4-醇、异松油烯、2-环氧丙烷、1-己醇等42 种化学成分[14]。洪化鹏等对异叶梁王茶鲜叶的精油组分进行分析，测得主要成份有月桂烯等11 种，经评香属花香型精油[15]。缪明志从异叶梁王茶和掌叶梁王茶的不同药用部位提取、分离、纯化梁王茶多糖，发现掌叶梁王茶的根中可溶性多糖含量最高，平均为 1.68%[16]。

关于掌叶梁王茶叶的化学成分及其抗氧化尚无报道，亦无梁王茶叶速溶茶粉的相关报道。因此本研究以掌叶梁王茶叶为原料，采用热水浸提法制备梁王茶叶速溶粉，比色法研究梁王茶叶及其速溶茶粉的化学组分及其抗氧化能力，并对梁王茶叶17 种游离氨基酸进行了测定，旨在为梁王茶的深度开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

掌叶梁王茶茶叶：由兰坪润民农产品有限责任公司提供。

牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）：生物试剂，上海源叶生物科技有限公司；茚三酮：生物纯，上海斯信生物科技有限公司；考马斯亮蓝（G-250）：高级纯，上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖、苯酚：分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司；浓硫酸：分析纯，重庆川东化工有限公司；乙腈：分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心。

Jan-80 离心机：常州市华普达教学仪器有限公司；ELX 808 酶标仪：美国伯腾公司；BILON-12 真空冷冻干燥机：郑州比朗仪器有限公司；HH-8 数显电子恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；AR224CN 电子天平：奥豪斯仪器有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 梁王茶速溶茶粉的提取工艺

1.2.1.1 梁王茶速溶茶粉提取工艺流程

干茶→粉碎→过200 目→热水浸提→过滤（纱布粗滤，再经滤纸抽滤）→减压浓缩（65 ℃）→真空冷冻干燥→速溶茶粉

1.2.1.2 正交试验

以浸提温度、浸提时间、料液比、提取次数这4 个因素为研究对象，按四因素三水平即L9（43）正交表进行试验，见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factor and level table of orthogonal design

每组试验均称取20 g 茶叶进行浸提，茶粉提取率的计算为：提取率/%=茶粉质量/原料茶叶质量×100

1.2.2 梁王茶叶及其速溶茶粉的化学成分测定

水溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[17]，标准曲线为：y=3.295x+0.003，R2=0.998（其中 x 为牛血清白蛋白浓度（mg/mL），y 为 595 nm 处吸光值）。水溶性氨基酸含量测定采用茚三酮比色法[18]，标准曲线为：y=0.796x-0.005，R2=0.993（其中 x 为谷氨酸浓度（mg/mL），y 为570 nm 处吸光值）。水溶性总糖、多糖含量的测定采用苯酚硫酸法[19-20]，标准曲线为：y=3.041x+0.039，R2=0.995 其中 x 为葡萄糖浓度（mg/mL），y 为 490 nm 处吸光值）。测定多糖含量时，茶叶和茶粉的制样方法分别为：茶叶与水的比例为1 g ∶30 mL，沸水浴浸提30 min，滤纸过滤，滤液定容至30 mL。取滤液1 mL，加4 mL 无水乙醇醇沉6 h，3 000 r/min 离心5 min，沉淀加10 mL水溶解即得多糖待测液；0.025 g 茶粉溶于10 mL 水中，从中取出1 mL 加4 mL 无水乙醇醇沉6 h，3 000 r/min离心5 min，沉淀加10 mL 水溶解即得多糖待测液。总多酚、总黄酮含量的测定采用福林酚比色法[21]，标准曲线为：y=5.416 1x+0.012，R2=0.997（其中 x 为没食子酸浓度（mg/mL），y 为 765 nm 处吸光值）。测定总黄酮时，样品的制样方法为[22]：于2 mL EP 管中，加入1 mL 测总多酚的样品、0.5 mL HCl（浓盐酸∶水=1 ∶4，体积比）、0.5 mL 35%甲醛，暗处放置24 h 后在3 000 r/min 下离心5 min，沉淀为黄酮，用福林酚法分析上清液中非黄酮含量。总黄酮含量=总多酚含量-非黄酮含量。游离氨基酸的测定：参照国标GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》，采用氨基酸分析仪（茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪）进行测定[23]。

1.2.3 抗氧化活性的测定

在黑城文书中，有一件标号为Y1: W 99的文书提到了儒学教授杨景仁，他是至正三年(1343)八月接受敕牒，至正四年二月到亦集乃路上任的。[注]前引李逸友编著《黑城出土文书(汉文文书卷)》，第123页。与这件文书中提到的“敕受亦集乃路儒学教授杨景仁”为同一人。该文书写于至正六年(1346)二月，当时杨景仁已经在亦集乃路执教整整两年了。

根据Wang 等[24]的方法测定梁王茶叶及其速溶茶粉对DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除能力。其清除率的计算方法如下：DPPH 自由基清除率/ %=（ADPPH-A样品对照-A样品）/ADPPH×100，其中 ADPPH为：780 μL 0.094 mmoL/L DPPH+20 μL 超纯水；A样品对照为：780 μL甲醇+20 μL 样品；A样品为 780 μL 0.094 mmoL/L DPPH+20 μL 样品，将上述溶液混匀，置于暗处放置30 min 后测得的吸光值。ABTS 自由基清除率/%=（AABTS-A样品）/AABTS×100，式中 AABTS为 1 mL ABTS 自由基工作液与10 μL 超纯水混匀反应后，所测吸光值；A样品为1 mL ABTS 自由基工作液与10 μL 样品混匀反应后，所测吸光值。

根据Heleno 等[25]的方法测定梁王茶叶及速溶茶粉的还原力，吸光值越大则还原力则越强。

1.3 数据处理方法

数据以平均值±标准差表示，所有数据先进行Grubbs 检验，以排除过失误差；经G 检验合格的数据，采用SPSS 19.0，用邓肯氏法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 梁王茶速溶茶粉提取的最佳条件

梁王茶速溶茶粉提取的正交试验结果见表2。

通过比较表2 中的极差R 可知，各因素关系为D>B>A>C，即对梁王茶速溶茶粉提取率的影响依次为提取次数>浸提时间>浸提温度>料液比；最佳因素水平组合为A3B3C3D3，即最佳的浸提条件为温度85 ℃，浸提 60 min，料液比 1 g ∶30 mL，浸提次数 3 次。按较优条件A3B3C3D3，进行3 重复的验证试验，得到梁王茶速溶茶粉的提取率为39.88%。

表2 梁王茶速溶茶粉提取的正交试验结果Table 2 Extraction of instant tea power from LWC leaves by orthogonal test

2.2 梁王茶叶及其速溶茶粉的化学成分分析

梁王茶叶及其速溶茶粉的化学成分分析见表3。

由表3 可知，除水分含量外，梁王茶速溶茶粉的各种成分含量均高于茶叶，这是因为梁王茶速溶茶粉是由梁王茶叶的水提物，经浓缩干燥后所得。梁王茶叶的主要化学组分含量依次为：水溶性总糖47.32 g/kg＞总多酚13.76 g/kg＞水溶性蛋白质9.58 g/kg＞水溶性氨基酸5.91 g/kg＞水溶性多糖1.89 g/kg＞总黄酮0.88 g/kg。梁王茶速溶茶粉的主要化学组分含量依次为：水溶性总糖236.05 g/kg＞水溶性蛋白质99.47g/kg＞水溶性氨基酸30.83 g/kg＞总多酚27.08 g/kg＞水溶性多糖17.99 g/kg＞总黄酮2.03 g/kg。由此可知，除总多酚外，梁王茶速溶茶粉中主要化学组分的含量高低与其原料梁王茶叶中相似。总多酚含量在梁王茶叶中高于水溶性蛋白质和氨基酸的含量，而在梁王茶速溶茶粉中低于水溶性蛋白质和氨基酸的含量，这是因为梁王茶速溶茶粉是由梁王茶叶水提物浓缩干燥而得，而梁王茶叶中的多酚可能主要为醇溶性多酚。梁王茶叶和速溶茶粉中的水溶性总糖含量均高于其他组分，其中茶叶中水溶性总糖的平均含量为47.32 g/kg，这与缪明志[16]报道的梁王茶中可溶性总糖的平均含量为60.5g/kg 相近。

表3 梁王茶叶及其速溶茶粉的化学成分分析Table 3 Chemical compositions of LWC leaves and its instant tea powder

总糖、多糖能够提供热能，维持血糖，参与构造组织细胞[26]；蛋白质可以增强机体抵抗力[27]；氨基酸是构成茶汤鲜爽滋味的主体成分[24]；多酚是茶汤滋味浓度和汤色的决定因素，但它又是涩味形成的主要物质，它的含量如果过高，则会明显的苦涩味，因此，对品质要求来说，多酚含量必须在一个适当的含量范围之内[28]；黄酮是一类具有抗菌、抗炎作用的物质[29]。从梁王茶速溶茶粉的主要化学组分可看出，其营养丰富，并含有一定量的多酚、黄酮及多糖等生物活性成分，是一款较为健康的速溶茶饮品。

2.3 梁王茶叶17种游离氨基酸的含量

图1 梁王茶叶17 种游离氨基酸含量Fig.1 Contents of 17 free amino acids in LWC leaves

由图1 可知，在梁王茶叶中共测得17 种游离氨基酸，其含量依次为组氨酸45.74 mg/kg＞天门冬氨酸29.85 mg/kg＞谷氨酸 14.34 mg/kg＞丝氨酸 11.89 mg/kg＞苏氨酸8.9 mg/kg＞赖氨酸7.90 mg/kg＞胱氨酸6.46 mg/kg＞精氨酸4.72mg/kg＞蛋氨酸4.59mg/kg＞脯氨酸4.30 mg/kg＞丙氨酸2.66mg/kg＞缬氨酸1.89 mg/kg＞甘氨酸1.64 mg/kg＞亮氨酸1.30 mg/kg＞络氨酸1.13 mg/kg＞苯丙氨酸0.99 mg/kg＞异亮氨酸0.86 mg/kg。组氨酸被认为是一种人类（主要是儿童）必需的氨基酸，组氨酸也是尿毒症患者的必需氨酸[30]。

2.4 梁王茶叶及其速溶茶粉的抗氧化活性

梁王茶叶及其速溶茶粉的抗氧化活性如图2 所示。

图2 梁王茶叶及其速溶茶粉的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of LWC leaves and its instant tea powder

如图2A～图2C 所示，在一定浓度范围内，随着梁王茶叶浓度增加，其对DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率，及其还原力均增加，与浓度呈正相关。梁王茶叶清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的IC50分别为3.92、12.84 mg/mL，表明梁王茶叶对DPPH 自由基的清除优于ABTS 自由基。吸光值越大还原力越强，梁王茶叶的还原力在2 mg/mL～15 mg/mL 范围内随浓度增加显著（P＜0.05）；而在 15 mg/mL～50 mg/mL 范围内，还原力增加平缓（P＞0.05）；在15 mg/mL 时，还原力达到2.966。

如图2D～图2F 所示，在一定浓度范围内，随着梁王茶速溶茶粉浓度增加，其对DPPH 自由基和ABTS自由基的清除率，及其还原力均增加，与浓度呈正相关。梁王茶速溶茶粉清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的IC50分别为1.60、1.36 mg/mL，表明梁王茶速溶茶粉对ABTS 自由基的清除优于DPPH 自由基。梁王茶速溶茶粉在0.1 mg/mL～2 mg/mL 范围内还原力显著增加（P＜0.05），在 2 mg/mL～3.5 mg/mL 范围内还原力增加不显著（P＞0.05），在 3.5 mg/mL 时，还原力为 3.343。梁王茶速溶茶粉是由梁王茶叶水提物浓缩干燥而得，其主要化学组分含量均高于梁王茶叶。其中梁王茶速溶茶粉的生物活性成分水溶性多糖（17.99 g/kg）、多酚（27.08 g/kg）、黄酮（2.03 g/kg）分别为梁王茶叶的 9.52、1.97、2.31 倍，因此其还原力，及对DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率均优于梁王茶叶。

3 结论

掌叶梁王茶叶的主要化学组分依次为水溶性总糖47.32 g/kg＞总多酚13.76 g/kg＞水溶性蛋白质9.58 g/kg＞水溶性氨基酸5.91 g/kg＞水溶性多糖1.89 g/kg＞总黄酮0.88g/kg，含量最多的游离氨基酸是组氨酸45.74 mg/kg。以掌叶梁王茶叶为原料，采用热水浸提法制备梁王茶速溶茶粉，其最佳浸提条件为料液比1 g ∶30 mL，温度85 ℃，浸提60 min，浸提次数3 次，此条件下速溶茶粉的提取率达到39.88%。所得梁王茶速溶茶粉的主要化学组依次水溶性总糖236.05 g/kg＞水溶性蛋白质99.47 g/kg＞水溶性氨基酸30.83 g/kg＞总多酚27.08 g/kg＞水溶性多糖17.99 g/kg＞总黄酮2.03 g/kg。梁王茶叶及其速溶茶粉清除DPPH 自由基的IC50分别为3.92、1.60 mg/mL；清除ABTS 自由基的IC50分别为12.84、1.36 mg/mL。梁王茶速溶茶粉的还原力，及对DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率均优于梁王茶叶。梁王茶速溶茶粉营养丰富，并含有一定量的多酚、黄酮及多糖等生物活性成分，有较强的抗氧化能力，是一款较为健康的速溶茶饮品。