生物钟基因介导卵巢功能调控的分子机制研究

丁萌楠，宋伦

军事科学院军事医学研究院 军事认知与脑科学研究所，北京 100850

昼夜节律是生命活动表现为以大致24 h 为周期的振荡规律现象，涉及机体的呼吸、代谢、免疫、心血管、运动、生殖等多系统功能调控。昼夜节律产生和维持的遗传学基础依赖于中枢和外周生物钟系统。在哺乳动物中，位于下丘脑的视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的中枢生物钟作为昼夜节律主起搏器，通过接受光信号来启动生物昼夜节律；外周生物钟存在于全身大多数外周组织中，可接受中枢生物钟控制，也可独立于SCN 而自主运行，调控与各组织特异性功能相关的基因表达。本文将着重阐述昼夜节律及生物钟系统对卵巢组织器官功能的影响及其在一些女性生殖相关疾病中的调控作用。

1 哺乳动物生物钟基因的调控

昼夜节律的产生和维持受生物钟基因调控。哺乳动物细胞中的生物钟分子调控系统是由十多个生物钟基因形成的负反馈转录翻译环路，包括bmal1、clock、cry、per、rev-erbα、rorα、dbp、tef、hlf等。bmal1基因编码一种具有碱性螺旋-环-螺旋/PAS 结构域（bHLH/PAS）的转录因子家族蛋白质，可以与CLOCK 蛋白结合形成BMAL1/CLOCK 异二聚体。在白天，转录因子BMAL1/CLOCK 异二聚体进入细胞核结合到生物钟基因per（per1，per2和per3）和cry（cry1和cry2）上游启动子的E-box 元件并激活其转录。per和cry被不断地转录和翻译，致使细胞质中的PER 和CRY 蛋白不断积累，并与酪蛋白激酶 I（CKIδ 和 CKIε）和AMP 活化蛋白激酶（AMPK）相互作用。在夜晚开始时，PER 和CRY 复合物转移至细胞核，与bmal1和clock的启动子区域的D-box 元件结合，发挥负性调节功能并抑制bmal1和clock的转录。而后随着 PER 和 CRY 在 CKIδ和 CKIε催化作用下发生磷酸化和泛素化修饰反应并被进一步降解，它们对bmal1和clock的转录抑制作用逐渐消失，BMAL1/CLOCK 异二聚体可以再次表达从而启动新的转录 循环[1-2]。 同时 ，CLOCK 和 BMAL1 二 聚体 还能结合核受体基因Rev-erbα/β和RORα/β启动子上的E-box 元件，促进其基因转录，来启动生物钟基因转录翻译震荡（transcriptional translational oscil⁃lator，TTO）机制的辅助环路。Rev-erbα/β和RORα/β转录翻译的 REV-ERBα/β和 RORα/β蛋白竞争结合bmal1启动子区的受体应答元件（orphan re⁃ceptor response element，RORE）。其中 ROR 蛋白促进bmal1转录，而 REV-ERBα/β蛋白抑制bmal1转录，因而产生对生物钟主环路的另一层次调控作用[3]。

除了以上核心生物钟基因以外，还有一些钟控基因（clock controlled genes，CCG）组成了另外一条潜在的转录调控环路，包括E4BP4（E4 pro⁃moter-binding protein 4）、DBP（albumin D-sitebinding protein）、HLF（hepatic leukemia factor）、TEF（thyrotroph embryonic factor）转录因子家族。其中，Dbp是BMAL1/CLOCK 异二聚体的直接靶基因，E4bp4是REV-ERBs 的直接靶基因，它们可通过 D-box 调控per基因的表达[5]。HLF 也表达出明显的昼夜节律循环相关性，并且作为该过程的输出调节剂，HLF 可以调节多方面保守的转录程序，其功能是抑制细胞死亡[6]。

2 生物钟基因与卵巢功能调控

卵巢包括2 个基本功能：一是卵母细胞的发育以及排卵；二是分泌与卵巢功能相关的固醇类激素，并为之后受精和胚胎着床提供有利的生殖系统环境。

2.1 生物钟参与卵泡发育

卵泡作为卵巢的基本结构和功能单位，经过一系列的发育过程（历经原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡、排卵前卵泡），最后卵泡破裂，开始排卵。许多研究表明，生物钟与卵泡发育之间存在相关性[7]。原始和初级卵泡中不存在生物钟基因表达的节律，但是一旦卵泡开始发育到达早期阶段，尤其是接近排卵前阶段时，生物钟基因表达的节律会变得稳定[8]。随着研究的逐步深入，有研究者在探讨生物钟蛋白在小鼠发情卵巢卵泡成熟过程中的作用时，发现了卵泡发育的4个阶段（原始、初级、次级和黄体）在光照和黑夜周期条件下bmal1、clock、cry1、cry2、per1和per2等生物钟基因的震荡表达变化。随着卵巢卵泡成熟，生物钟蛋白的正反馈成分（BMAL1、CLOCK）和负反馈成分（CRY1、CRY2、PER1 和 PER2）均发生变化[9]。与此相对应，哺乳动物卵巢功能受昼夜节律调控。例如生物钟可调节成熟卵母细胞的募集和释放。当卵泡被募集用于生长时，卵泡中的颗粒细胞和卵泡膜细胞等也经历一系列生物钟基因转录和翻译震荡活动。其中生物钟基因bmal1、clock、per1、cry1直到植入前胚胎时期都可在卵母细胞中稳定表达[10]。per1、per2和bmal1基因在大鼠卵巢的卵泡内颗粒细胞和卵泡膜细胞中节律性表达。在卵泡募集后生长中的卵泡（直径 7～8 mm）颗粒细胞中，clockmRNA 表达增加，并且卵泡刺激素刺激了从小卵泡分离的颗粒细胞中clock基因的表达[11]。另外，clock和per2在人卵巢的有腔卵泡中表达，敲低这2 个生物钟基因会抑制用卵泡刺激素处理后的颗粒细胞功能，包括细胞增殖、类固醇产生和促黄体生成素受体表达。而卵泡的发育离不开颗粒细胞的营养支持，颗粒细胞分泌的细胞因子和营养物质可通过细胞之间的间隙链接来调控卵母细胞生长、发育及成熟，因此颗粒细胞的功能受到影响进而也会引起卵泡发育障碍[12]。此外，clock和per2还被证实分别与从募集到优势卵泡选择阶段和从选择阶段到排卵阶段的卵泡发育有关[11]。

2.2 生物钟参与排卵

卵巢生物钟与卵巢对促性腺激素的反应性和排卵存在一定关系。通常，SCN 区的中枢生物钟会驱动促性腺激素释放激素（gonadotropinre⁃leasing hormone，GnRH）的节律释放，GnRH 会刺激垂体前叶释放的卵泡刺激素（follile-stimulating hormone，FSH），FSH 刺激卵泡的生长和成熟，并且GnRH 的节律释放还刺激了发情前的促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）分泌，而LH 排卵前激增可导致卵泡破裂及排卵。因此，卵巢对LH的敏感性也呈现24 h 的周期变化。早先有研究认为，卵巢中的生物钟和排卵时间之间的联系可能涉及前列腺素信号的参与。其中，颗粒细胞对LH 反应的重要步骤之一是前列腺素水平的升高，包括前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）和前列腺素 F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）。环氧化酶 2（cyclooxygenase-2，COX2）为前列腺素合成的限速酶，由于其基因ptgs2启动子区存在E-box结合位点，因此COX2 的表达受BMAL1/CLOCK 复合物调控，这是生物钟基因表达改变可能影响到卵巢排卵过程的潜在机制[13]。生物钟影响啮齿动物排卵所需的LH 激增还表现在排卵会在每个动情周期的同一时间发生[14]。另外，类固醇激素（例如LH、FSH）也会对核心生物钟基因的表达产生影响，比如LH 诱导颗粒细胞中生物钟基因bmal1、clock及per2的震荡表达，LH 和 FSH 均激活未成熟的大鼠颗粒细胞中per2的振荡表达[15-16]。此外还有研究表明，在雌性哺乳动物中，排卵的时间取决于由成熟卵母细胞产生的高循环雌二醇和位于视交叉上核中的生物钟提供的每日信号所导致的短暂LH 激增，并且已有实验检测到下丘脑和垂体生物钟基因表达的节律；也就是说，卵巢生物钟和SCN 及下丘脑-垂体-卵巢（hy⁃pothalamo pituitary ovary axis，HPO）轴上各生物钟同步协调才能保证正常排卵[17]。Kisspeptin（Kiss1）是下丘脑调节GnRH 分泌的重要神经内分泌多肽，是生殖功能的关键调节因子。前腹侧室旁核AVPV Kiss1 神经元具有控制LH 峰出现的功能。研究发现，前腹侧室旁核AVPV 中生物钟基因per1、bmal1的表达具有节律震荡特征，因此推测前腹侧室旁核AVPV 可能存在节律震荡器感受SCN 信号，并控制Kiss1 的释放时间[18]。Kiss1还被证实在人类和啮齿动物的不同卵巢区室中表达，并且受促性腺激素的控制，卵巢Kiss1 和Kiss1 受体在大鼠的排卵和动情周期的调节中发挥关键作用[19]。上述证据表明，下丘脑、垂体和卵巢一起形成昼夜节律振荡生殖轴，并形成了卵巢各种生殖功能维持的重要机制。

2.3 生物钟参与类固醇激素生成

雌二醇（estrogen，E2）和FSH 是颗粒细胞增殖和分化的协同刺激激素，FSH 可通过诱导细胞色素 P450 芳 香 酶（cytochrome P450 aromatase，cyp19）mRNA 表达诱导产生 E2。而孕酮（proges⁃terone，PG）和PGE 是排卵和黄体化的必需激素，COX2、细胞色素 P450 家族 scc（cytochrome P450 scc11，CYP11A)、固 醇合成 急性调 节蛋 白（ste⁃roidogenie acute regulatory protein，STAR）和 3-β羟类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroid dehydroge⁃nase deficiency，3β-HSD）都是 PGE 和 PG 合成所需的关键酶，LH 可显著增加关键酶相关基因表达[20]。研究发现，小鼠的bmal1基因敲除会出现STAR 功能障碍，继而类固醇激素合成减少，导致雌雄鼠的不孕不育[13]。雌鼠bmal1表达的下调会影响卵巢黄体细胞中与PG、PGE 合成相关的基因表达，并且卵巢颗粒细胞中bmal1的缺失破坏了PG 的产生，并随后导致雌性小鼠的植入失败[21]。因此有研究者认为，卵巢bmal1基因调控类固醇激素和前列腺素的合成，因此怀孕的bmal1敲除小鼠具有比野生型小鼠更低的孕酮血清水平以及胚胎生存率，受损的类固醇生成似乎成为生物钟基因突变体中的常见问题[22]。同时研究表明，生物钟基因per2和clock参与颗粒细胞中类固醇产生，clock与颗粒细胞中 E2 产生和lhrmRNA 和cyp19a1mRNA 表达的诱导有关。2 个生物钟基因per1和per2及其基因产物在大鼠卵巢的颗粒细胞和卵泡膜细胞中表达，并且显示出24 h 的节律性。per2且与雌性动物的生殖过程和动情周期相关，可通过抑制CLOCK/BMAL1 异二聚体来抑制STAR 表达进而抑制黄体酮产生[23]。CRY 在卵巢中也可能发挥重要生理功能，可通过调节类固醇激素的合成或通过转录调节控制发情周期[24]。人卵巢颗粒细胞中生物钟基因调控与人卵巢类固醇生成的相关性也有报道[15]。有研究证明，人类颗粒细胞中所有已知生物钟的存在，随着年龄的增长，昼夜节律的逐渐破坏可能会导致人卵巢黄体中类固醇生成的失调[25]。以上研究结果说明卵巢生物钟系统与类固醇激素的生成存在关联性，生物钟基因的扰动或敲除可影响类固醇的生成及相关基因的表达。

3 卵巢生物钟与女性生殖系统疾病

3.1 繁殖力下降及流产率增加

众所周知，卵巢钟的慢性破坏可对啮齿动物模型和轮班工作的女性生殖功能和生育能力产生负面影响。生物钟基因单个基因的缺失或突变不仅导致昼夜节律性中断，而且还导致雌性生殖功能受损。bmal1 null小鼠虽有发情周期，但往往是不规则的，且卵巢小于野生型小鼠，会出现胚胎植入失败。另外，早在2010 年就有研究表明生物钟基因bmal1中的多态性会增加流产的百分比，并且卵巢颗粒细胞或卵泡膜细胞中bmal1基因的条件性敲除会导致排卵和植入失败[26]；per1和per2基因突变小鼠可怀孕，但与野生型小鼠相比，成功分娩和断奶的幼仔数量减少[14]；clock突变小鼠很少怀孕，它们具有高的胎儿重吸收率和严重的难产，胎儿表现出形态异常，并且有研究者用小发夹RNA（shRNA）方案在体外和体内特异性敲低clock基因表达，发现会导致细胞凋亡以及繁殖能力下降，从而增加流产风险[27]。

3.2 多囊卵巢综合征

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是生育年龄妇女最常见的内分泌疾病。最近的一项研究强调了生物钟基因在PCOS 发展中的重要作用，并且研究表明PCOS 组女性颗粒细胞BMAL1 表达水平低于无PCOS 组。高雄激素血症是PCOS 的一个标志性特征，并且与该疾病的发生密切相关。高雄激素血症可影响昼夜节律基因per2表达，以及影响类固醇生成相关基因star的表达，从而导致颗粒细胞中类固醇激素生成的紊乱，导致PCOS 的发展[28-29]。

3.3 卵巢癌

昼夜节律同样影响细胞周期及细胞分裂，并在肿瘤的恶性转化中具有重要的调控作用[30]。卵巢癌是女性第四大常见恶性肿瘤，并且是妇科恶性肿瘤死亡的主要原因。与正常卵巢细胞相比，卵巢癌细胞中的生物钟基因发生明显改变，例如PER1、PER2、CRY2 和 CLOCK 的表达显著降低。与此同时，通过操控生物钟基因的表达也可以影响肿瘤治疗效果。大量研究表明，bmal1的过表达抑制卵巢癌细胞生长并增强其对化疗药物顺铂的反应敏感性；而抑制clock基因表达会影响抗药蛋白表达来达到逆转卵巢癌细胞系的顺铂耐药性的目的[31]。

3.4 感染性疾病

革兰阴性菌会引起女性生殖道上行感染，进而导致女性盆腔炎（pelvic inflammatory disease，PID）的发生。脂多糖（LPS）是革兰阴性细菌外膜的主要成分，可以干扰正常的卵巢功能，而且LPS也会扰乱生物钟节律，进而影响卵巢功能变化。通过腹膜内注射LPS 可导致血液中炎性细胞因子如白细胞介素（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达水平升高，其中Rev-erbα调节IL-6 的表达，并且TNF-α的表达可表现出由生物钟基因（bmal1、clock）调控的昼夜节律振荡性[32]，而TNF-α和IL-6会抑制体外培养的颗粒细胞中CYP19A1 和LHR的表达，说明LPS 可能通过影响颗粒细胞或卵泡膜细胞的功能来诱导卵巢功能障碍。此外研究还发现了LPS 通过抑制小鼠卵巢中per2的表达进而抑制CYP19A1 和LHR 表达并干扰正常的卵巢功能[33]。这些研究结果有助于了解生物钟在调节哺乳动物卵巢病理生理功能中的贡献。

4 结语

哺乳动物卵巢生物钟在雌性生殖系统功能正常发挥过程中具有重要作用。卵巢生物钟作为外周生物钟，受到SCN 区中枢生物钟的控制，并且需要HPO 轴上各生物钟的协调同步运行，才能保证正常的生殖功能。通过近十年的研究，对哺乳动物生物钟在促性腺激素分泌、卵泡成熟、卵巢类固醇激素产生、排卵、子宫植入和分娩、哺乳过程等的贡献有了初步了解，并形成了指导临床生殖系统疾病治疗的新思路。目前，从时间生物学角度来调节HPO 轴的生物钟功能被认为是治疗常见生育障碍的新途径，特别是那些由慢性昼夜节律破坏引起的生育障碍。未来，将生物钟作为提高生育率或改善复杂生育障碍的可行性手段仍有巨大的开发潜力。