癌相关成纤维细胞的特性及其调控肿瘤进程的研究进展

万令飞，杨慧，葛晨，刘蕴慧，岳文，裴雪涛，阎新龙

1.北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124；2.军事科学院 军事医学研究院 卫生勤务与血液研究所军事再生医学研究室，北京 100850；3.华南生物医药研究院 华南干细胞与再生医学研究中心，广东 广州 510005

癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibro⁃blasts，CAF）是肿瘤组织中活化的成纤维细胞，作为肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中重要的细胞组成部分，能够分泌多种活性因子参与肿瘤微环境的调控，在肿瘤的增殖与侵袭转移、肿瘤微血管的生成、肿瘤细胞的耐药性、介导肿瘤免疫逃逸等多个方面发挥着重要作用。

1 癌相关成纤维细胞的定义

对于CAF 的确切定义目前还存在许多争议，主要原因是CAF 与基质中其他细胞，如成纤维细胞、肌成纤维细胞、间充质干细胞共享多种标志物[1]，因此在肿瘤微环境中，CAF 与正常成纤维细胞之间的差异，通常是根据功能性来定义，而不是由个别特异性标记基因定义。另外，CAF 的多种来源也决定了寻找一种确切的特异性标志成为挑战，因而定义CAF 成了极其关键的问题。

1.1 CAF的表型

恶性肿瘤中的CAF 与来源于正常组织的成纤维细胞在表型上差异较大。CAF 具有更强的增殖能力，生成更多的胶原蛋白，分泌生长因子和其他细胞外基质活性因子。与正常的成纤维细胞相比，从胃癌中提取的CAF 表现出更强的增殖与迁移能力[2]。

1.2 CAF的特异性标记

常用于定义CAF 的标志物有α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）、成纤维细胞特异性蛋白（fibroblast specific protein，FSP）和血小板衍生生长因子受体β（platelet de⁃rived growth factor receptor-β，PDGFRβ）。尽管人们提出了多种标记基因和蛋白来定义CAF，但现在发现这些标记不能完全标记所有的CAF，其中一些标记不是CAF 所独有的。在某些情况下，例如来自8 对患者结肠癌的CAF 与正常组织的成纤维细胞相比，正常的成纤维细胞比CAF 表达更高的α-SMA[3]，并且在其他细胞类型如心脏细胞中也能检测到α-SMA 的表达[4]。FAP 也不是CAF独有的，在小鼠的多个正常组织中均发现了FAP阳性的基质细胞[5]，而在一些CD45+免疫细胞[6]、癌相关血管周细胞[7]中，也能够检测到FAP 的表达。

以上证据表明，迄今还没有一个确切的特异性标记能够将CAF 与其他细胞区分，此限制将大大阻碍对CAF 的功能和机理的认识，以及开发靶向CAF 的抗肿瘤治疗的研究进展。

2 CAF的来源

围绕CAF 的来源有几种理论，但目前仍有争议，但越来越多的研究报告了几种细胞作为CAF的来源：①常驻组织成纤维细胞，组织间质中的正常成纤维细胞在肿瘤细胞分泌的生长因子和细胞因子刺激下活化，是CAF 最主要的来源；②脂肪细胞；③血管周细胞；④上皮细胞与内皮细胞分别通过上皮间质、内皮间质转化为CAF；⑤骨髓间充质干细胞通过迁移至肿瘤基质中，被肿瘤活化为CAF。

2.1 常驻组织成纤维细胞

最常见的观点认为CAF 来源于常驻组织成纤维细胞。研究表明，肿瘤来源的外泌体能够通过激活TGF-β信号通路，促进成纤维细胞分化为CAF[8]，癌细胞还能通过 miRNA（miR-31、miR-214和miR-155）的作用将正常成纤维细胞诱导为CAF[9]。在前列腺癌中，肿瘤组织募集骨髓来源的间充质干细胞，进而分泌TGF-β1，将正常的成纤维细胞转化为更多的CAF[10]。另外，静息状态的胰腺星状细胞和肝星状细胞在被邻近的肿瘤细胞激活后，表达α-SMA 蛋白，获得 CAF 表型[11-12]。

2.2 脂肪细胞

在肿瘤组织中也能观察到大量的脂肪细胞，其中脂肪干细胞与癌细胞相邻，直接与肿瘤细胞相互作用。脂肪细胞被转化为CAF[13-14]，将用绿色荧光蛋白标记的脂肪组织与鼠乳腺癌细胞注射到小鼠皮下，能观察到脂肪细胞被募集到肿瘤微环境中并表达α-SMA，获得CAF 表型[15]。

2.3 周细胞

周细胞与内皮细胞紧密结合，在维持血管和血管生成中起重要作用[16-17]。周细胞不仅保留了祖细胞的特征，在病理条件下还可以分化为成纤维细胞。胃癌细胞通过外泌体激活周细胞中的PI3K/AKT 和MEK/ERK 途径，诱导其向 CAF 转化[18]。

2.4 上皮细胞与内皮细胞

上皮间质转化是指细胞从具有紧密连接的上皮表型转变为具有松散的细胞-细胞黏附的间质细胞[19]，被认为是上皮癌转移的潜在机制。

需要注意的是，癌细胞与CAF 中的遗传改变很少一致，这表明肿瘤中的间质细胞只有一小部分来源于肿瘤细胞[20]。内皮细胞能够通过内皮-间质转化转化为成纤维细胞样细胞，Zeisberg 等发现TGF-β1 能够诱导内皮细胞发生表型转化为成纤维细胞样，并且这种EndMT 与FSP1 的表达与CD31/PECAM 的 下调 有关[21]。

2.5 骨髓间充质干细胞

间充质干细胞（MSC）被认为是另一种CAF 前体细胞。Mishara 等证明将人骨髓间充质干细胞（BM-MSC）长时间暴露于肿瘤条件培养基从而获得CAF 的功能特性，包括持续表达基质衍生因子1（SDF-1）、α-SMA 及 FSP，并且在体内、外能够促进肿瘤增殖[22]。在幽门螺杆菌诱导的小鼠胃癌模型中，研究者用α-SMA-启动子报告载体示踪发现，至少20%的CAF 起源于BM-MSC[23]。另有研究者向荷瘤小鼠注射BM-MSC，也证明其可以分化为CAF[24]。与此相类似，研究者证明PDGFRα阳性的CAF 来源于MSC[25]。肿瘤来源的GRP78 通过激活TGF-β/Smad 信号通路引起了BM-MSC 向CAF 分化[26]。

总之，CAF 的起源尚未明了，深入探究各种细胞转化为CAF 的机制，将有助于提高我们对不同CAF 起源的认识，促进了解不同的CAF 的表型和功能。

3 CAF的异质性

近年来随着对CAF 群体了解的深入，越来越多的证据表明CAF 群体中存在着不同表型的亚群，不同的亚群在肿瘤发生发展过程中可能扮演着不同的角色。

3.1 表型异质性

例如常用于鉴定CAF 的标记α-SMA 和FAP等，仅仅是因为其在CAF 中高表达，而非特异性表达。人们还发现在CAF 群体内部，这些常用的标记也并非总是能够特异标记CAF。研究者证明肿瘤微环境中CAF 的一些亚群表达FAP，而在其他的CAF 亚群中却没有FAP 的表达[27]，这对于将FAP 当作潜在临床试验靶标无疑是一个挑战。另一个常用的CAF 标志α-SMA，研究者在胰腺导管腺癌中发现存在一个CAF 亚群，其在旁分泌因子诱导下，从成肌纤维样细胞转变为炎症样的 CAF，导致α-SMA 表达量大幅下降[28]。

3.2 功能异质性

在胰腺导管腺癌中发现2 个CAF 亚群，邻近肿瘤细胞的CAF 高表达α-SMA，生成细胞基质；而远离肿瘤细胞的CAF 低表达α-SMA，并且分泌IL-6 和其他炎性因子[28]。这2 种CAF 分别被命名为 myoCAF 和 iCAF。

单细胞RNA 测序技术的发展，使得在单细胞水平上定量分析细胞转录组的差异成为可能，克服了大批量RNA 测序数据中掩盖细胞亚群的问题。研究者利用单细胞RNA 测序技术，在小鼠乳腺癌模型中，通过分析CAF 亚群独有的基因，将CAF 分为4 群，分别是起源于血管周细胞的vCAF亚群；来源于常驻组织成纤维细胞的mCAF 亚群；与vCAF 重叠，但具有高增殖能力的cCAF 亚群；与肿瘤上皮间质转换的dCAF[29]，这为研究乳腺癌CAF 的异质性提供了有力的证据。在乳腺癌转移性腋窝淋巴结转移瘤中，研究者将CAF 分为4个亚群，其中 CAF-S1（FAPHighCD29Med-Highα-SMAHigh⁃PDPNHighPDGFRβHigh）和 CAF-S4（FAPLow-MedCD29Highα-SMAHighPDPNLowPDGFRβMed）亚群与乳腺癌转移扩散有关[30]，表明CAF 亚群在转移性扩散中表现出独特的功能，为乳腺癌的精准治疗提供了进一步的证据。

4 CAF在肿瘤中的作用

活化的CAF 不仅可通过合成细胞外基质（ex⁃tracellular matrix，ECM）组分（如胶原蛋白和纤连蛋白等）形成基质结构框架，还可直接与癌细胞和其他微环境细胞发生相互作用。

4.1 CAF促进肿瘤细胞增殖和转移

CAF 促进肿瘤功能的机制，最常见体现在其与癌细胞之间的旁分泌信号传导，其中CAF 分泌生长因子和细胞趋化因子，如IL-6、HGF、EGF、IGF、SDF-1 等[31]促进肿瘤细胞的增殖与转移能力，从而促进肿瘤的发生发展。同时肿瘤细胞也能分泌细胞因子激活CAF，进而促进肿瘤细胞自身的侵袭性[32]。另外CAF 可以通过释放外泌体作用于肿瘤细胞，促进肿瘤进程[33]，在口腔鳞状细胞癌中，CAF 分泌的外泌体将miR-382-5p 转运至肿瘤细胞中，促进口腔肿瘤细胞迁移和侵袭[34]。

重塑细胞外基质是CAF 促进肿瘤迁移的另一种方式[35-36]。在前列腺癌中，CAF 可以通过高水平表达纤连蛋白（Fn）而改变ECM 的结构，使得前列腺癌细胞能够通过整联蛋白在ECM 中定向迁移，类似现象也发生在头颈癌[37]与乳腺癌中[38]。

4.2 CAF促进肿瘤细胞的耐药性

研究表明，CAF 能够提高癌细胞对化疗药物的耐药性[39-40]。最常见的解释是，CAF 分泌外泌体作用于肿瘤细胞，激活下游信号通路，从而降低肿瘤细胞对药物的敏感性。在胃癌中，CAF 来源的外泌体携带miR-522 作用于胃癌细胞，抑制ALOX15 并减少脂质ROS（一种由铁依赖的脂质过氧化物）在肿瘤细胞中的积累，最终导致药物敏感性降低[41]。CAF 分泌的外泌体miR-196a 通过靶向CDKN1B 和ING5，在头颈癌中赋予肿瘤细胞顺铂耐药性[42]。CAF 来源的外泌体miR-92A-3p 激活结肠直肠癌细胞Wnt/β-catenin 途径并抑制线粒体凋亡，从而促进结肠直肠癌中肿瘤干细胞的干性基因表达与化疗耐药性[43]。CAF 促进肿瘤细胞化疗耐药性的另一种方式是通过促进肿瘤细胞中肿瘤干细胞（CSC）亚群存活。CSC 被认为是肿瘤细胞中具有肿瘤干性的亚群，与化疗后肿瘤复发密切相关[44-45]，研究证明，CAF 通过释放IL-17A 激活结直肠癌干细胞的NF-κB 通路及其下游靶标ERK1/2，增强了其对化疗的耐药性[46]。这为增加肿瘤细胞化疗敏感性提供了另一种思路，因为大多数增加化疗敏感性的方法专注于阻断肿瘤细胞自身的信号通路，而忽略了微环境对于肿瘤干细胞的作用。

4.3 CAF促进肿瘤中血管形成

肿瘤的生长依赖于肿瘤组织中的血管生成，CAF 可以通过分泌 VEGF、FGF 和 IL-6 等多种促血管生成因子，有效促进肿瘤组织的血管生成[47]，也能通过SDF-1 将内皮祖细胞招募到肿瘤组织中，促进血管生成[48]。对于不依赖VEGF 的血管生成，也有报道称miR-205/YAP 介导的CAF 活化也能促进血管生成[49]，这将有助于进一步了解肿瘤微环境中CAF 对于血管生成的作用。

4.4 CAF参与肿瘤微环境中的免疫调节

CAF 还能够直接参与肿瘤微环境中的免疫调节，FAP+CAF 能够分泌趋化因子CXCL12，促使胰腺导管腺癌小鼠对免疫检查点拮抗剂失去响应，发生免疫逃逸[50]。CAF 还能影响肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的功能[51]，CAF 通过分泌 CXCL12/SDF1、M-SCF 和IL-6，促进募集巨噬细胞并诱导其分化为免疫抑制表型的Ⅱ型巨噬细胞[52-55]。CAF 还与肿瘤微环境中嗜中性粒细胞的募集有关，中性粒细胞通过 CAF 分泌的 CXCL1、CXCL2 和 CXCL5 被招募至肿瘤组织内，释放活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、蛋白酶等影响肿瘤的发生。CAF 还可以影响先天免疫细胞——自然杀伤（NK）细胞的活性，CAF 分泌的 TGF-β1 能够使得依赖于 TGFβ1的NKp30 表达下调，显著抑制NK 细胞介导的免疫杀伤[56-57]。还有研究证明，CAF 能够诱导骨髓来源的抑制细胞（MDSC）生成和激活，促进免疫抑制，从而为癌症的发生发展创造有利条件[58-60]。

4.5 CAF抑制肿瘤

尽管CAF 有强大的促肿瘤作用，但也有报道称某些CAF 亚群具有肿瘤抑制功能。CD146-CAF 可赋予乳腺癌细胞他莫昔芬耐药性，而CD146+CAF 则能够逆转这种表型，提高药物敏感性[61]。在胰腺导管腺癌小鼠模型中敲除α-SMA+CAF 时，反而促进肿瘤发生，导致生存率下降[62]。这些证据表明，在某些肿瘤中存在抑制肿瘤细胞的CAF 亚群，非选择性地靶向整个CAF 群体可能效果差甚至起相反结果。找到更为可靠的CAF特异性标记，区分在肿瘤中发挥促进或抑制功能的CAF 亚群，才能更有针对性地进行靶向治疗。

5 靶向CAF的抗肿瘤治疗

由于肿瘤微环境中CAF 发挥的重要作用，越来越多的研究将CAF 视为癌症患者的治疗靶标。

5.1 靶向CAF下游信号通路的抗肿瘤治疗

由于CAF 分泌多种调控因子，可以通过阻断来自CAF 的信号，从而减少其对肿瘤细胞的正向调控作用。涉及肿瘤微环境中CAF 的信号分子从功能上大致分为2 类。一类是招募和激活CAF的分子，如IL-6，其能激活下游JAK1/STAT3 信号通路从而激活CAF[63]，靶向IL-6、IL-6 受体或JAK的药物已获美国食品和药物管理局批准[64]。而通过阻断CAF 中的PDGFR 信号传导，显著抑制FGF2 和FGF7 的表达，可抑制肿瘤微环境中血管生成和肿瘤增殖[65]。另一类是CAF 衍生的细胞因子与趋化因子。例如，CAF 是许多肿瘤中趋化因子CXCL12 的主要来源，靶向阻断CXCL12 作用于肿瘤细胞可以促进T 细胞募集，并与检查点拮抗剂α-PD-L1 协同作用达到抑制肿瘤[66-67]。

5.2 靶向CAF亚群的抗肿瘤治疗

基于前述CAF 的异质性，最理想的情况是靶向促进肿瘤的CAF 亚群，将其重编程为正常的成纤维细胞或抗肿瘤的CAF 表型。研究者利用卡泊三醇作为维生素D 受体的配体，能够将活化的CAF 恢复到静息状态，从而增强了化疗药物的功效[68]。在乳腺癌中，CD10+GPR77+CAF 被认为是维持肿瘤细胞干性并促进肿瘤形成和化疗耐药性的一个亚群，中和阻断GPR77 能够显著抑制肿瘤的进程[69]。这些证据凸显了定义CAF 亚群以及探究其在肿瘤发生过程中所发挥功能的重要性。

随着对CAF 介导的多种削弱抗肿瘤免疫作用认识的加深，针对CAF 的免疫疗法将是很有吸引力的选择。

综上所述，CAF 通过参与肿瘤微环境中的复杂调控，促进肿瘤细胞的增殖和转移能力，提高肿瘤微环境中的免疫抑制，最终造成肿瘤的发生发展。近年来，随着对CAF 与肿瘤和肿瘤微环境中免疫细胞相互作用机制的深入研究，越来越多的证据表明CAF 有望成为抗癌治疗的靶点。但目前仍然存在许多亟待解决的问题，例如寻找CAF 特异性标志物，探寻不同CAF 亚群的分类、特性及其在肿瘤中的作用等，亟须对CAF 进行深入系统的研究。