新培斯病毒介导的病原体疫苗研制现状

李文桂,陈雅棠

重庆医科大学附属第一医院 传染病寄生虫病研究所，重庆 400016

新培斯病毒（Sindbis virus，SinV）是一种感染鸟类的虫媒病毒，可波及人类，出现以关节痛、斑丘疹和发热为特征的新培斯热。新培斯病毒的基因组大小为11.8 kb，可插入3.2 kb 的外源基因，是一种理想的疫苗载体。pSinrep5、pSinrep504和pSin-Lacz 等载体是新培斯病毒的高效表达载体[1-2]，pVAX-EGFP、pVAX-Gluc 和 pBR-EGFP 等重组质粒可以表达绿色荧光蛋白（GFP）、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）或高斯虫体萤光素酶（Gluc），这为筛选重组新培斯病毒提供了方便[3-4]。重组新培斯病毒的复制子含有病毒基因组的5′和3′端的顺式作用序列以及复制/转录酶编码基因，病毒结构蛋白的基因被外源基因所替代，复制/转录酶控制载体RNA 在宿主细胞胞浆内的复制以及亚基因组织mRNA 表达外源基因，由辅助载体RNA提供反式互补结构蛋白在宿主体内将复制子RNA 包装成重组病毒颗粒。基于RNA 和SinV 的复制子需要体外合成加帽的RNA，并且不稳定；基于DNA 和RNA 的双功能复制子载体操作简单，表达效率高[5-8]。国内外学者报道了大量表达病原体蛋白的重组新培斯病毒，这些病原体包括汉城病毒、LAC 病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、风疹病毒、狂犬病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、Ⅰ型人类免疫缺陷病毒、日本脑炎病毒、传染性胃肠炎病毒、单纯疱疹病毒1型、刚地弓形虫、约氏疟原虫、埃及伊蚊、结核分枝杆菌和炭疽杆菌等。本文简要综述以新培斯病毒为传递载体的病原体疫苗的研制现状。

1 重组新培斯病毒抗病毒

1.1 布尼亚病毒

1.1.1 汉城病毒 汉城病毒（Seoul virus，SeoV）是肾综合征出血热的病原体之一，其基因组的M/S基因分别编码糖蛋白（glycoprotein，GP）和核壳蛋白（nucleocapsid protein，NP），将 GP/NP 的 DNA 疫苗或重组蛋白免疫仓鼠可产生中和抗体[9-10]。Ka⁃mrud 等[11]以汉城病毒 SR-11 株的总 RNA 为模板扩增 M/S 基因，插入 pWRG 得 pWRD-M/S，与 pSin⁃rep5 重组得pSinrep5-M/S，转化幼仓鼠肾细胞（BHK-21），Western 印迹提示重组病毒表达的相对分子质量（Mr）69 000 的 G1、50 000 的 G2 及46 000 的N 蛋白可被患者血清所结合。采用皮下注射途径将3 μg 重组质粒接种仓鼠，在第一次接种后3、6 周加强2 次，在第一次接种后9 周血清 IgG 和中和抗体滴度分别为 1∶1600～1∶6400 和1∶160～1∶2560，此时通过肌肉注射用 103PFU 有毒株进行攻击，攻击后4 周血清IgG 和中和抗体的滴度分别为1∶200～1∶3200 和1∶320～1∶25 600。

1.1.1 拉克罗斯病毒 拉克罗斯病毒（Lacrosse virus，LACV）是虫媒性脑炎的病原体之一。M 负链的mRNA 编码一个多聚体，随后裂解为糖蛋白G1 和G2。将G1 和G2 的重组蛋白免疫仓鼠可诱导宿主产生中和抗体[12]。Kamrud 等[13]以pMORF为 模 板 扩 增 1154 bp 的 G2、3474 bp 的 G1 和2651 bp 的 TG1 基 因 ，插 入 pSinrep5 得 pSinrep5-G2/G1/TG1，将它们分别转化 BHK-21 细胞，West⁃ern 印迹提示重组病毒表达的Mr为38 000 的G2、125 000 的 G1 和 60 000 的 TG1 蛋 白 可 被 患 者 血清所结合，但未报道保护力的试验结果。

1.2 披膜病毒

1.2.1 委内瑞拉马脑炎病毒 委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus，VEEV）的26S RNA 的C 端是结构蛋白编码区，经过突变成为 TC-83，其 N 端的未翻译区（UTR）G3A 位点突变成为G3A[14-15]，这些突变株可诱导宿主产生更多的IFN-α，从而提高机体的免疫应答。Paessler等[16]将 pTC-83 与 pSinV 重组得 pSinV-83S，加辅助质粒转化BHK-21 细胞，Western 印迹提示重组病毒表达的E1 蛋白可被患者血清所结合。经皮下注射途径将106PFU 疫苗接种Swiss 鼠，接种后3 d 提示血清中和抗体上升，此时皮下注射106PFU委内瑞拉马脑炎病毒Ie 株SH3 型进行攻击，攻击后7 d 免疫组和对照组的存活率分别为100%（10/10）和 0（0/10）。Maruggi 等[17]将 G3A 基因插入pSinrep5 得pSinrep5-G3A，加辅助质粒转化BHK-21 细胞，免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋白分子。经肌肉注射途径将106IU 疫苗接种BALB/c 鼠，第一次接种后3 周加强1 次，第一次接种后5 周血清IgG 上升，脾细胞的CTL 活性增强，流式细胞仪（FACS）检测表明脾 IFN-γ+CD4+和CD8+T 细胞数目明显增多。

1.2.2 风疹病毒 风疹病毒（Rubella virus，RubV）是风疹的病原体，糖蛋白E1 和E2 和壳蛋白（CP）均是主要的结构蛋白，具有一定的免疫原性[18]。Chen 等[19]以风疹病毒的基因组DNA 为模板扩增166 bp 的 E1、923 bp 的 E2 和 839 bp 的 CP 基 因 ，插入 pH251 得 pH251-E1/E2/CP，与 pToto2JCI 重组得 pToto-E1/E2/CP，分别转化 BHK-21 细胞，West⁃ern 印迹提示重组病毒表达的Mr为60 000 的E1、43 000 的 E2 以及 32 000 的 CP 蛋 白 可被患者血清所结合。

1.3 弹状病毒

1.3.1 狂犬病毒 狂犬病毒（Rabies virus，RaV）是狂犬病的病原体，其糖蛋白（rabies virus glycopro⁃tein，RGP）是一种较好的免疫蛋白[20]。Saxena 等[21]以pTarget-RVG 为模板扩增RVG 基因，插入pAL⁃pha 得 pALpha-RVG，将 其 转 化 BHK-21 细 胞 ，Western 印迹提示重组病毒表达的Mr为67 000 的RVG 蛋白可被患者血清所结合。采用肌肉注射途径将50 μg 重组质粒接种Swiss 鼠，第一次接种后 21 d 加强 1 次，第一次接种后 5 周血清 IgG 上升，脾细胞增殖，可分泌高水平的IL-2、IFN-γ和IL-4 等细胞因子，FACS 检测表明脾CD4+和CD8+T 细胞数目增多，此时皮下注射20 LD50狂犬病毒CVS 株进行攻击，攻击后2 周免疫组和对照组的存活率分别为100%（10/10）和0（0/10）。

1.3.2 伪狂犬病毒 伪狂犬病毒（Pseudorabies vi⁃rus，PRV）是伪狂犬病的病原体，其糖蛋白gB/gC/gD 具有较好的免疫原性，将糖蛋白的DNA 疫苗免疫仔猪可产生较好的保护力[22]。Dufour 等[23]以伪狂犬病毒的基因组DNA 为模板扩增gB/gC/gD基因，插入 pCR-Ⅱ得 pCR-gB/gC/gD，与 pSincp 重组得pSincp-gB/gC/gD，将它们分别转化猪肾细胞株（PK15），免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋 白 分 子 。 将 340 μg 的 pSin-gB、pSin-gC 和pSin-gD 等量混合组成混合疫苗，经肌肉注射途径接种8 周龄仔猪，第一次接种后3 周加强1 次，第一次接种后6 周血清IgG 上升，外周血单核细胞（PBMC）分泌高水平IFN-γ，此时用106.3TCID50有毒株进行滴鼻攻击，攻击后6 d 免疫组和对照组的存活率分别为100%（8/8）和0（0/8）。

1.4 RNA病毒

1.4.1 口蹄疫病毒 口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）是家畜口蹄疫的病原体。P1-2A 是壳蛋白前体，在蛋白水解酶3C 作用下裂解为 VP1、VP2、VP3 和 VP4，其中 VP1 存在许多细胞表位。将VP1 蛋白的合成肽或DNA 疫苗免疫小鼠或仔猪均可抵抗口蹄疫病毒有毒株的攻 击[24-25]。 Dory 等[26]将 P12A3C3D 基 因 插 入 pSincp得pSincp-P12A3C3D，将其转化BHK-21 细胞，免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋白分子。将 1020 μg 重组质粒加 340 μg pSincp-GM-CSF组成混合疫苗，采用肌肉或皮下注射途径接种7周龄仔猪，第一次接种后2 和4 周加强2 次，第一次接种后6 周血清IgG 和中和抗体上升，皮下注射组的抗体水平高于肌肉注射组。

MEG990 是一个多价表位基因，是将口蹄疫病毒的O 型、A 型和亚洲型VP1 序列的C 端串联起来而成的，含有2 个免疫显性表位和1 个B 细胞 表 位[27]。 Dar 等[28]以 pET-MEG990 为 模 板 扩 增1 kb 的 MEG990 基因，插入 pSinCMV-Vac 得 pSin⁃CMV-MEG990，转化 BHK-21 细胞，Western 印迹提示重组病毒表达的Mr为17 000 的蛋白可被患者血清所结合。采用肌肉注射途径将1、2、5 和10 μg 重组质粒接种豚鼠，接种后4 周血清IgG 和中和抗体上升，此时肌肉注射103GPID50口蹄疫病毒A 株进行攻击，攻击后7 d 观察足垫皮损，结果发现 1、2、5 和 10 μg 接种组以及对照组的保护力分别为 0（0/6）、0（0/6）、16.7%（1/6）、33.4%（2/6）和0（0/6），提示高剂量接种组的免疫效果优于低剂量接种组。

1.4.2 丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒（Hepatitis virus C，HCV）是丙型肝炎的病原体，E 区基因编码GP33 和GP72 蛋白。付娟娟等[29]以pVRC-HCV为模板扩增 1.7 kb 的 E1E2 基因，插入 pBR-XJ 得pBR-E1E2，与 pVA-XJ 重组得 pVA-E1E2，加辅助质粒转化BHK-21 细胞，Western 印迹提示重组病毒 表 达 的Mr为 35 000 的 E1 和 60 000 的 E2 蛋 白可被患者血清所结合。

1.5 其他病毒

1.5.1 麻疹病毒 麻疹病毒（Measles virus，MV）是麻疹的病原体，将其血凝素（H）和融合蛋白（F）的DNA 疫苗接种小鼠可诱导高水平的中和抗体[30]。Pasetti 等[31]采用肌肉注射途径将 100 μg rSin-H/F 接种棉鼠，第一次接种后4 周加强1 次，第一次接种后8 周通过皮下注射方法用5×104TCID50麻疹病毒的减毒株加强2 次，第一次接种后12 周血清 IgG 上升，ELISPOT 检测发现血 PBMC的 IFN-γ+SFCs 数目增加，此时用 2×107TCTD50麻疹病毒Edmonston 株进行滴鼻攻击，攻击后4 d 取肺检查病毒负荷，结果提示rSinV-H 免疫组、rSinV-F 免疫组和对照组的保护力分别为100%（16/16）、81%（13/16）和0（0/16）。

1.5.2 Ⅰ型人类免疫缺陷病毒 Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）的结构基因 gag 编码核衣壳蛋白 P24、P7 和内膜 蛋 白 P14。 Kong 等[32]将 GagCRF08 基 因 插 入pSinrep5 得 pSinrep5-GagCRF08，与 pSinrep15 重组得pSinrep19-GagCRF08，将其转化BHK-21 细胞，Western 印迹提示重组病毒表达的Mr为50 000 的pr55Gag 蛋白可被患者血清所结合。

env 基因编码一种前体蛋白gp160，gp160 可裂解为 gp120 和 gp41。 Van Marle 等[33]将 env 基因插入 pSL1180 得 pSL-env，与 pSinrep5 重组得 pSin⁃rep5-env，加 pDH-BB 转化 BHK-21 细胞，Western印迹提示重组病毒表达的Mr为120 000 的gp120蛋白可被患者血清所结合。采用肌肉注射途径将 5×105IU 的疫苗接种 SCID/NOD 鼠，接种后 7 d取脑组织，发现接种组小鼠的脑组织发生变性，神经元丢失，免疫鼠的行为学出现异常改变。

1.5.3 日本脑炎病毒 日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是日本脑炎的病原体。膜前蛋白（premembrane protein，PrM）是膜蛋白M 的糖基化前体，外膜蛋白（envelope glycoprotein，E）是被膜糖蛋白，非结构蛋白1（nonstructural pro⁃tein 1，NS1）是糖基化蛋白。将 PrM/E 和 NS1 的重组蛋白免疫小鼠可对抗JEV 有毒株的攻击[34-35]。Pugachev 等[36-37]以日本脑炎病毒cDNA 为模板扩增prM/E 和 NS1 基 因，插入 pSinrep5 得 pSinrep5-prM/E/NS，将它们分别转化 BHK-21 细胞，Western 印迹提示重组病毒表达的prM/E 和NS1 蛋白可被患者血清所结合。采用腹腔注射途径将107PFU 疫苗接种Swiss 鼠，接种后3 周血清IgG 和中和抗体上升，此时腹腔注射3×108PFU 日本脑炎病毒进行攻击，攻击后3 周rSin-prM/E 免疫组、rSin-NS1免疫组和对照组的存活率分别为40%（8/20）、15.8%（3/19）和 0（0/20），提示 rSin-prM/E 免疫组的保护力高于rSin-NS1 免疫组。

1.5.4 传染性胃肠炎病毒 传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）是人畜胃肠炎的常见病原体之一。S 基因编码的被膜蛋白（envelope protein，E）在病毒聚集和释放中起作用。Ortego 等[38]以传染性胃肠炎病毒PUR46-MAD株的DNA 为模板扩增249 bp 的E 基因，插入pSL-SC11 得 pSL-E，与 pSinrep21 重 组 得 pSin⁃rep21-E，将其转化 BHK-21 细胞，Western 印迹检测发现重组病毒表达的Mr为12 000 的E 蛋白可被患者血清所结合，Southern 杂交提示目的基因整合入病毒的基因组中。

1.5.5 单纯疱疹病毒1 型 单纯疱疹病毒1 型（Herpes simplex virus type 1，HSV-1）是疱疹的病原体之一，将其糖蛋白gB 的DNA 疫苗免疫小鼠可诱导有效的保护力[39-40]。Hariharan 等[41]以单纯疱疹病毒1 型KOS 株的DNA 为模板扩增3555 bp的 gB 基因，插入 pCI 得 pCI-gB，与 pSin2.5 重组得pSin2.5-gB，转化 BHK-21 细胞，Western 印迹检测发现重组病毒表达的Mr为110 000 的gB 蛋白可被患者血清所结合。采用肌肉注射途径将0.01、0.1、0.3、3 和 100 μg 重组质粒接种 BALB/c 鼠，接种后2 周血清IgG 上升，脾细胞的CTL 活性增加，此时腹腔注射5×107PFU 单纯疱疹病毒1 型Mck⁃rae 株进行攻击，攻击后2 周各组的存活率分别为34%（11/32）、82%（48/52）、97%（31/32）和 100%（15/15），表明重组质粒的接种剂量可影响免疫效果，接种剂量愈大，免疫效果愈好。

2 重组新培斯病毒抗寄生虫

2.1 刚地弓形虫

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，Tg）是弓形虫病的病原体，将其表面抗原1（surface antigen 1，SAG1）接种小鼠可产生较好的保护力[42]。Xiong等[43]将 P30（SAG1）基因插入 pGEX-1N 得 pGEXP30，与pToto2J1 重组得pTJ-P30，加辅助质粒转化BHK-21 细胞，Western 印迹检测发现重组病毒表达的Mr为56 000 的P30-GST 融合蛋白可被患者血清所结合，但未进行保护力试验。

2.2 约氏疟原虫

约氏疟原虫（Plasmodium yoelii，Py）是一种常见的鼠疟原虫，Py 环子孢子蛋白（Py circumsporo⁃zoite protein，PyCSP）在子孢子入侵肝细胞的过程中起关键作用。Tsuji 等[44]采用皮下注射途径将5×106PFU 疫苗 接种 BALB/c 鼠 ，接 种后 2 周 经FACS 证实脾CD8+T 细胞数目增多，此时静脉注射2×104约氏疟原虫的子孢子进行攻击，攻击后42 h 取肝，RT-PCR 定量显示免疫组的肝Py rRNA 水平下降80%左右。

2.3 埃及伊蚊

埃及伊蚊（Aedes aegypti）是登革热的主要传播媒介。R2D2 是一种传播阻断性抗原，可以干扰伊蚊的发育[45]。Geiss 等[46]将 R2D2 基因插入pBG78 得 pBG78-R2D2，加 pBG44 转化 BHK-21 细胞，Western 印迹检测发现重组病毒表达的Mr为40 000 的R2D2 蛋白可被患者血清所结合。

3 重组新培斯病毒抗细菌

3.1 结核分枝杆菌

结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis，MTB）是结核病的病原体，Ag85 具有分枝菌酸转移酶活性，在细菌细胞壁合成晚期起关键作用。将Ag85 的DNA 疫苗免疫小鼠可有效抵抗MTB 的攻 击[47]。 Kirman 等[48]以 结 核 分 枝 杆 菌 DNA 为 模 板扩增 Ag85A 基因，插入 pcDNA3.1 得 pcD-Ag85A，与pSincp 重组得pSincp-Ag85A，将其转化BHK-21细胞，Western 印迹检测发现重组病毒表达的Ag85A 蛋白可被患者血清所结合；采用皮下注射途径将100 μg 重组质粒接种C57BL16 鼠，第一次接种后2 周加强1 次，第一次接种后4 周脾细胞分泌高水平IFN-γ，此时雾化吸入500 CFU 结核分枝杆菌Erdman 株进行攻击，攻击后4 周免疫组肺组织的细菌免疫负荷下降至1/8 左右。

Derrick 等[49]以 PJW4303-tpA85B 为 模 板 扩 增Ag85B 基因，插入 pCR2-1 得 pCR2-1-Ag85B，与pSincP 重组得 pSincp-Ag85B，转化 RD 细胞；从重组病毒中抽提总RNA 作为模板，用RT-PCR 方法可克隆出Ag85B 基因。采用肌肉注射途径将5 μg 重组质粒接种C57BL/6 鼠，第一次接种后3 和6周加强2 次，第一次接种后10 周血清IgG 上升，此时雾化吸入300 CFU 结核分枝杆菌Erdman 株进行攻击，攻击后190 d 免疫组肺组织的细菌负荷下降至1/7 左右。

3.2 炭疽杆菌

炭疽杆菌（Bacillas anthracis）是炭疽的病原体，其保护性抗原的结构域4（protective antigen domain 4，PAd4）含有中和表位，具有一定的免疫原 性[50]。 Thomas 等[51]将 PAd4 插 入 pE2S1 得pE2S1-PAd4，加辅助质粒转化BHK-21 细胞，免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋白分子。采用肌肉注射途径将107PFU 疫苗接种Swiss 鼠，第一次接种后2、4 和6 周加强3 次，第一次接种后8周血清IgG 和中和抗体上升，此时用10 LD50炭疽杆菌孢子进行滴鼻攻击，攻击后30 d 免疫组和对照组的存活率分别为20%（2/10）和0（0/10），当加用头孢呋辛时，免疫组的存活率可达90%（9/10）。

4 结语

重组新培斯病毒疫苗作为一种新型疫苗具有下述优点：新培斯病毒复制子的基因组小，操作简单，生产方便；在宿主细胞内短暂、高水平表达外源蛋白；在宿主胞浆内转录mRNA，消除了潜在的mRNA 拼接事件；重组新培斯病毒转染细胞后，在细胞质中合成大量正、负链RNA，组成大量双链RNA 复制中间体；抗原提呈细胞TLR3 受体可识别双链mRNA，诱导IFN 和TNF-α产生，促进免疫应答[52]；双链RNA 可激活宿主细胞内RNase L 和PKR 等途径，诱导细胞凋亡[53]；感染的细胞凋亡后可避免外源基因整合进宿主细胞的染色体基因组中，提高了生物安全性[54]；新培斯病毒的宿主范围广；新培斯病毒本身无免疫背景，很少存在免疫耐受问题；新培斯病毒具有嗜神经性，对于中枢神经系统疾病的治疗非常有吸引力[55]。

重组新培斯病毒是一种新型疫苗，用于感染的防治具有十分广阔的前景。但将重组新培斯病毒发展成为一种理想疫苗亟待解决下述问题：重组新培斯病毒疫苗高效启动子和增强子的研究；重组新培斯病毒表达蛋白的翻译后修饰及调控；多价重组新培斯病毒的研制；口服重组新培斯病毒的研制；重组新培斯病毒的新的选择标志筛选；重组新培斯病毒的接种剂量、次数和间隔时间探索等。随着这些问题的阐明，我们对重组新培斯病毒用于感染防治将更有信心。