在线净化-液相色谱法快速测定熏烤水产品中的苯并（a）芘

章骅，陈旭艳，张靓文

（天津海关动植物与食品检测中心，天津300461）

苯并（a）芘[benzo（a）pyrene，BaP]，属于多环芳烃类。1933 年，英国学者从煤焦油中分离出苯并芘，并诱发了小鼠皮肤癌，使BaP 成为第一个被发现的环境化学致癌物，且致癌性很强，是世界公认的三大致癌物之一，BaP 可引发皮肤、肺、食道等部位的肿瘤和癌变[1-2]，同时还具有致畸性和致突变性，能通过母体经胎盘影响子代，从而引起胚胎畸形或死亡以及免疫功能下降[3-4]。熏烤鱼及其制品在熏烤过程中可以产生酚类、有机酸和内脂等活性物质，带来独特的风味、色泽和芳香，深受消费者的喜爱[5]。但是，熏烤过程中木炭等燃料的不完全燃烧和脂类、蛋白质和碳水化合物等有机物的热解会产生副产物多环芳烃（polycyclic aromativ hydrocarbons，PAHs），其中毒性最大的当属 BaP。又因其亲脂性，BaP 易积蓄在脂肪组织内[6-7]。因此，检测此类食品中BaP 的含量显得尤为重要。我国GB 2762-2017 《食品安全国家标准食品中污染物限量》[8]规定熏、烤水产品中BaP 的限量为5.0 μg/kg。欧盟法规No 835/2011《食品中多环芳烃限量》规定熏烤鱼及其鱼制品的肌肉部分中BaP 的含量要≤2 μg/kg。

国内外不少研究已经建立了BaP 的检测方法，主要采用薄层层析法、荧光分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法等[9-11]。经过多次的修订，现行国家标准GB 5009.27-2016 《食品安全国家标准食品中苯并（a）芘的测定》[12]废止了部分较陈旧的检测方法，采用液相色谱-荧光检测器法测定。该标准用正己烷提取熏烤水产品中的BaP，用中性氧化铝柱或分子印迹柱进行富集净化，操作繁琐费时，溶剂毒性大，尤其是中性氧化铝柱活度难以控制，回收率不稳定。而大量使用有机溶剂，如果试剂不纯有BaP 残留，洗脱后经浓缩而被富集，易出现假阳性情况。

针对上述问题，本研究基于GB 5009.27-2016《食品安全国家标准食品中苯并（a）芘的测定》，对检测方法进行了优化，通过在线固相萃取对熏烤鱼样品进行净化，建立了在线净化-液相色谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

BaP 标准溶液：德国 Dr.Ehrenstorfer 公司，1 000 mg/L；乙腈：色谱纯，德国Merck 公司；乙酸乙酯、异丙醇：均为色谱纯，Dikma 公司；无水硫酸钠：分析纯，天津市佑洁化工贸易有限公司；Acclaim C8（4.6 mm×10 mm，5 μm）：美国 Thermofisher 公司；Ultimate PAH（4.6 mm×250 mm，5 μm）：Welch 公司；所有试验用水均为去离子水（经Millipore 纯水系统纯化，电阻＞18.2 MΩ）；烤鱼片：市售。

U-3000 液相色谱仪（配有3000 型紫外检测器，3100 型荧光检测器）：美国 Thermofisher 公司，3100 型荧光检测器；Mili-Q 型纯水仪：美国Millipore 公司；IKA T18 型高速均质器、IKA HS 501digital 型平板振荡器：德国IKA 公司；ME 204 型分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

在线净化柱：Acclaim C8（4.6 mm×10 mm，5 μm）；分析柱：Ultimate PAH（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；荧光检测器参数：激发波长384 nm，发射波长406 nm；进样量 100 μL；分析柱流动相：A 为乙腈，B 为水，乙腈-水（体积比 80 ∶20）等度洗脱，流速1.2 mL/min，净化柱流动相：A 为乙腈，B 为水，C 为乙酸乙酯，流速1.0 mL/min。净化柱流动相梯度洗脱条件及切换阀位置见表1。

表1 净化柱流动相梯度洗脱条件及切换阀位置Table 1 The mobile phase gradient elution condition of the clean up column and the position of the switching

1.2.2 试验方法

称取2.00g（精确至0.001g）样品于50mL 离心管中，加入无水硫酸钠2.0 g 和20 mL 乙酸乙酯以20 000 r/min高速均质2 min，8 000 r/min 离心 10 min，过 0.45 μm有机滤膜后，供液相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 在线净化柱的选择

对于BaP 标准溶液，常规的C8、C18柱和Chrom－Spher Pi 柱都可实现在线富集的作用。但原理并不相同。ChromSpher Pi 利用供体与受体结合的原理，作为π 电子供体的BaP 与π 电子受体的固定相结合而别保留在净化柱上。C8和C18是疏水性最强的硅胶基体吸附剂，对非极性化合物都有较强的保留能力，使用较为广泛。苯并芘为弱极性物质，因此都可被二者保留。ChromSpher Pi 柱售价较高，因此本试验对比了相对低价的C8柱和C18柱。C18对极性弱的物质的保留能力强，而C8的碳链较短，保留能力相对弱，所以样品中油脂在C18柱保留较强不能完全排出，在流路切换后有可能将油脂带入分析柱，进而污染分析柱。因此，本试验选择C8柱作为在线净化柱，样品经乙酸乙酯提取后上样，随乙腈-水（体积比80 ∶20）进入净化柱，此时C8柱对BaP 没有保留，油脂类基质被保留，BaP 直接进入分析柱进分析。BaP 完成转移后，切换阀切换回初始状态，利用乙酸乙酯对净化柱进行梯度洗脱，将高保留的油脂成分快速洗脱，同时活化净化柱。

2.2 提取溶剂的选择

分别采用乙腈、异丙醇、乙酸乙酯、正己烷对样品进行提取，结果发现乙腈、异丙醇提取效率较低（回收率仅50%）；正己烷极性太小，制得的样品溶液油脂含量较大，可能导致固相萃取柱过载，且正己烷挥发性过强，可能影响进样精密度；而采用乙酸乙酯属中等极性，提取效率和回收率相对较好，能够保证BaP 的提取，同时带入杂质较少，可减少不同样品间干扰；加入无水硫酸钠可对样品溶液进行脱水处理，进一步减少干扰，避免乳化现象的发生。

2.3 进样量的确定

本试验为了减少前处理步骤，缩短操作时间，没有对样品提取液进行浓缩处理，采用提取液直接进样/在线前处理的方式分析。样品经过提取被稀释了10倍，为了得到与GB5009.27-2016 《食品安全国家标准食品中苯并（a）芘的测定》相当的灵敏度，将进样量扩大了5 倍，为100 μL。经测试方法灵敏度可满足检测要求，BaP 标准色谱图见图1。

图1 BaP 的标准色谱图Fig.1 Chromatogram of BaP

2.4 线性方程和方法检出限

按照GB5009.27-2016《食品安全国家标准食品中苯并（a）芘的测定》配制 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的校准曲线溶液，稀释10 倍后进样，得到校准曲线的线性方程为Y=29 928.133 0X-5.198 0，线性相关系数R2=0.999 9，BaP 校正曲线见图2。

图2 苯并（a）芘的校准曲线Fig.2 Standard curve of BaP

结果表明，BaP 在 0.5 ng/mL～20.0 ng/mL 质量浓度范围与峰面积具有良好的线性关系。以峰面积为基线噪声的3 倍浓度推算方法的检出限，BaP 的检出限为0.035 ng/mL。

2.5 方法的重复性和回收率

选取烤鱼空白样品，进行 0.5、5.0 μg/kg 和 10.0 μg/kg 3 个水平添加BaP 回收试样，每个水平重复测定6 次，计算回收率和相对标准偏差，回收率为89.6%～99.0%，相对标准偏差为1.3%～3.1%。具体见表2。

表2 回收率试验结果Table 2 Recovery of BaP

烤鱼样品空白色谱图见图3，烤鱼空白样品添加 5.0 μg/kg 水平BaP 色谱图见图4。

图3 烤鱼空白样品色谱图Fig.3 Chromatogram of blank sample

图4 烤鱼空白样品加标5.0 μg/kg 色谱图Fig.4 Chromatogram of blank sample with 5.0 μg/kg BaP standard solution

3 结论

本试验采用在线固相萃取技术建立熏烤水产中的BaP 含量的测定方法。只需对样品进行简单的提取后，即可上机进样分析。减少有机试剂和耗材的使用量，无需人工操作，避免了人为误差，省时省力，重现性好，回收率稳定。本方法平均回收率为89.6%～99.0%，相对标准偏差为1.3%～3.1%。适用于大量熏烤水产品样品的快速检测。