齐墩果酸和熊果酸提取、分离与测定方法研究进展

付亚玲，高琳，张东旭，张敏，郑振佳，张仁堂，*

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东泰安271018；2.龙大食品集团有限公司，山东烟台265231）

齐墩果酸，又名土当归酸，存在于190 余种植物中，分子式为C30H18O3，白色针状结晶，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿等[1]。熊果酸，又称乌索酸，分子式为C30H48O3，易溶于乙醇、甲醇、氯仿等，不溶于水和石油醚[2]，存在于60 余种植物中。齐墩果酸和熊果酸互为同分异构体，都是弱酸型五环三萜类化合物，结构式见图1。

图1 齐墩果酸和熊果酸的结构式Fig.1 Structure of oleanolic acid and ursolic acid

齐墩果酸和熊果酸以游离或与糖结合成苷的形式广泛存在于自然界[3]。齐墩果酸和熊果酸具有低的细胞毒性和广泛的生物活性，如保肝、抗炎、抗氧化、抗癌、调节免疫、降血糖和降血脂等[4-7]。齐墩果酸的抗癌活性具有毒副作用小和安全型高等特点，熊果酸具有美白和抗氧化功能被广泛的应用在化妆品领域。齐墩果酸和熊果酸结构复杂，在人工合成过程中步骤较繁琐，目前主要为从天然植物中提取再精制得到[8]。本文对近年来齐墩果酸和熊果酸提取、分离及含量测定方法的研究现状进行综述，为不同植物中齐墩果酸和熊果酸的相关研究和开发利用提供参考。

1 提取方法

1.1 传统提取方法

1.1.1 回流提取法

回流提取法常用乙醇作为提取溶剂，该方法操作简单、方便，但具有消耗大量溶剂、操作麻烦等缺点[9]。黄小云等[10]考察了乙醇浓度、料液比、回流温度、回流时间对毛葡萄酿酒皮渣中齐墩果酸提取效果的影响，通过正交试验确定的最佳工艺条件为：95%的乙醇，料液比 1 ∶35（g/mL），回流温度 35 ℃，回流时间 45 min。刘刚等[11]利用响应面法优化了乙醇回流提取锁阳熊果酸工艺条件，结果得出影响熊果酸提取率的各因素大小顺序为：乙醇体积分数＞提取温度＞提取时间＞液料比，最佳工艺条件：80%乙醇、提取温度78 ℃、提取时间 1.6 h、料液比 14 ∶1（g/mL）、提取 2 次，熊果酸提取率97.72%。黎海彬[12]通过正交试验优化了回流法提取山楂中熊果酸条件，结果表明：最佳提取工艺是固液比 1 ∶10（g/mL），90%乙醇，提取时间 2.5 h，提取温度80 ℃，该工艺下熊果酸浸出率达1.07%。周康[13]用传统乙醇回流法在回流温度95℃，按料液比1 ∶9（g/mL），回流时间90 min 条件下提取齐墩果酸，其得率达到0.34%。

1.1.2 浸提法

浸提法是较常用的提取方法，按照相似相溶的原理把目标物从植物中提取出来，此方法简单易行但耗时长[9]。郭梅等[14]利用乙醇为浸提剂提取山楂中熊果酸，通过正交试验分析其各因素对熊果酸提取率的影响大小为：乙醇浓度＞提取温度＞浸提时间＞料液比，最佳浸提工艺参数：乙醇浓度90%、浸提温度80 ℃、料液比 1 ∶30（g/mL）、浸提时间 2 h 时，熊果酸得率 0.262%。王志等[15]用浸提法提取木瓜中齐墩果酸和熊果酸，在单因素试验基础上，用正交试验优化提取工艺，结果得出最佳参数：95%乙醇，温度60 ℃，提取时间3 h，提取2 次，齐墩果酸和熊果酸料液比分别为1 ∶8（g/mL）和 1 ∶6（g/mL），得率分别为 0.59%和 0.12%。张海泉等[16]以浸提法研究了料液比，提取温度，提取时间，乙醇浓度4 个因素对苦丁茶熊果酸提取的影响，确定了工艺参数为液料比为17 ∶1（g/mL）、乙醇浓度为83%、提取温度83 ℃时提取率最佳，其中料液比对熊果酸得率影响最大。

1.2 新型提取法

1.2.1 超声波辅助提取

超声波辅助提取是超声波通过介质时使它们膨胀进而产生机械振动、空化作用和热效应破碎细胞结构来提高得率的方法[17]。孙协军等[18]用响应面法优化了超声波辅助提取山楂中熊果酸和齐墩果酸，结果表明最佳提取工艺参数为：乙醇体积90%，液固比35 ∶1（mL/g），功率 352 W，提取时间 4.6 min，齐墩果酸和熊果酸含量为2.87 mg/g。Xia 等[19]研究了超声波辅助提取女贞子中齐墩果酸和熊果酸，结果表明最佳提取条件为：95%乙醇，料液比为 1 ∶20（g/mL），超声温度40 ℃，提取时间10 min，在此条件下齐墩果酸和熊果酸得率分别为（6.3±0.25）mg/g 和（9.8±0.30）mg/g，且各因素对熊果酸提取率影响比齐墩果酸显著。罗小芳等[20]在单因素基础上，采用响应面法优化超声辅助提取宣木瓜齐墩果酸和熊果酸的工艺参数，得出影响齐墩果酸和熊果酸得率的3 个因素顺序是：超声时间＞乙醇浓度＞超声功率，最佳提取工艺条件为：乙醇浓度95%，超声时间3.8 min、超声功率440 W，齐墩果酸和熊果酸总得率为4.03 mg/g。和传统提取方法相比，超声波辅助提取法具有提高齐墩果酸和熊果酸效率，缩短提取时间的优点。

1.2.2 微波辅助提取

微波是利用频率介于300 MHz 和300 GHz 之间的电磁波的热效应促使细胞壁破裂来释放出细胞内有效成分以提取齐墩果酸和熊果酸的方法[9]。Vetal 等[21]用微波辅助提取罗勒叶中熊果酸和齐墩果酸，在微波功率 272 W、提取时间 3 min 时，料液比 1 ∶30（g/mL）最佳条件下，齐墩果酸和熊果酸提取率分别达到86.76%和89.64%，与超声辅助和浸提相比，微波辅助提取具有时间短和效率高等优点。蔚波等[22]研究了微波辅助提取木瓜渣中齐墩果酸的工艺，通过单因素试验和正交试验，结果显示在微波功率200 W，料液比1 ∶8（g/mL），乙醇浓度70%，提取温度65 ℃，提取时间30 min 的条件下齐墩果酸的提取量为2.712 mg/g。汪文浩等[23]分别对比微波辅助法、热回流提取法、超声波辅助法提取枇杷花中齐墩果酸和熊果酸，其结果显示微波辅助法比其他方法提取率高，其最佳工艺为：80 %乙醇，液固比 40 ∶1（mL/g），时间 50 min，温度 50℃，微波功率300 W，齐墩果酸和熊果酸提取量分别为0.482 mg/g 和3.118 mg/g。

1.2.3 酶解辅助提取

酶解辅助提取法的原理是酶解可以破坏细胞壁结构并将组织分解，从而提高提取率[24]，常用的酶有果胶酶、纤维素酶和蛋白酶等。张辉[25]用纤维素酶对木瓜中齐墩果酸进行提取，运用正交试验优化工艺参数以提高齐墩果酸得率，试验所得最佳酶解条件为：酶解pH 5.0，酶添加量0.3 %，酶解温度50 ℃，酶解时间为2 h，该条件下齐墩果酸得率达3.7 mg/g。张明等[26]比较了纤维素酶、果胶酶以及纤维素酶和果胶酶联合作用提取苦丁茶中熊果酸，结果表明单纯的纤维素酶提取效果最优，通过正交试验优化，确定最合适的工艺参数：酶解温度50 ℃，酶解时间2.5 h，酶量6 mg/g，酶解pH 5.2，熊果酸提取率为1.26%。

2 分离纯化方法

齐墩果酸和熊果酸分离纯化方法主要有大孔树脂吸附法、离子交换树脂法和硅胶柱色谱法等[27]。大孔吸附树脂、离子交换树脂和硅胶柱色谱分离原理分别为物理吸附可选择性的吸附分离提纯物质、可交换基团与溶液中各种离子间依据不同离子交换能力进行分离纯化和利用各组分吸附或溶解性能的不同进行目标化合物的分离纯化[28-29]。黄新苹等[30]对比AB-8、HPD-100、D-101 3 种型号的大孔树脂对女贞子中齐墩果酸分离纯化效果，试验表明AB-8 与D-101 树脂分离纯化效果好。张俊等[31]先运用静态吸附与解吸试验，筛选出AB-8 和HPD100 型两种最优树脂，并得出树脂质量比为1 ∶2 时纯化扁桃果皮熊果酸效果最佳，再通过响应面法优化纯化工艺得出在上样液浓度0.31 mg/mL，上样液 pH 5.01，上样液流速 1.0 mL/min；洗脱液浓度90%，洗脱液pH 5.06，洗脱液流速1.0 mL/min条件下熊果酸的纯度由6.35%提升到32%。杨裕启等[32]用凝胶型阴离子交换树脂纯化齐墩果酸，在树脂粒度100 目、吸附和洗脱温度30 ℃、洗脱液乙醇体积为80%最佳纯化条件下，女贞子中齐墩果酸纯度达98%以上。李钐等[33]采用乙醇浸提法提取山楂熊果酸和齐墩果酸后，用硅胶柱色谱分离纯化，用石油醚-丙酮（体积比5 ∶1）洗脱，分段收集，熊果酸和齐墩果酸含量达92%。

3 含量测定

关于齐墩果酸和熊果酸的测定方法早期有报道紫外分光光度法[34]，但此方法紫外吸收很弱，处于检测器边缘，灵敏度不高。目前常采用的测定方法有：高效液相色谱法、液质联用法、毛细管电泳法等[35-36]。周晓英等[37]建立了反相高效液相色谱法测定6 种新疆红枣中齐墩果酸和熊果酸含量，结果显示齐墩果酸平均含量为 310.4 μg/g，熊果酸为 244.1 μg/g。Park 等[38]应用高效液相色谱-蒸发光散射法测定木瓜中熊果酸含量，采用C-4 柱，以0.1%三氟乙酸的乙腈-水流动相梯度洗脱，得出熊果酸的平均含量为0.364%～0.557%。Ma等[39]以BATES 为衍生剂，建立了高效液相液相色谱-荧光-质谱联用测定紫堇属植物齐墩果酸含量的方法，结果表明在灰绿黄堇植物中没有检测出齐墩果酸含量，其余3 种紫堇属植物中齐墩果酸在根、茎、叶、花中总含量分别为（25.5±4.59）、（47.74±4.27）、（133.99±6.73）、（76.62±5.87）μg/g。张军等[40]以对硝基苯甲酰氯为衍生剂，用柱前衍生化高效液相色谱法测定了牛膝齐墩果酸平均含量为0.19%。李成等[41]采用高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）检测枣中齐墩果酸和熊果酸含量，通过精密度、重现性和稳定性试验得出齐墩果酸和熊果酸平均含量为 84.42 μg/g 和 3.67 μg/g。Chen 等[42]用高效液相色谱与质谱联用测定山茱萸、女贞子、山楂等九种草药熊果酸与齐墩果酸平均含量为0.007 mg/g～6.957 mg/g 和 0.004 mg/g～5.963 mg/g，其检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）分别为 0.005 μg/mL 和 0.020 μg/mL。张颖等[43]应用毛细管电泳法分析了齐墩果酸和熊果酸在南蛇藤不同部位中的分布，结果显示齐墩果酸和熊果酸在根、茎、皮、叶中的含量分别为 0.256 1、0.674 8、0.519 0、0.183 2 mg/g 和0.372 0、0.158 8、0.109 7、0.067 7 mg/g。

4 总结与展望

齐墩果酸和熊果酸是许多植物的有效成分，具有广泛的生物活性和低毒性等特点，尤其是抗癌和抗肿瘤功效，在保健品、食品和药品方面将会有广阔发展的前景。从目前的研究发展来看，存在的问题主要有：齐墩果酸和熊果酸结构、理化性质和药理活性相近，对于同时含齐墩果酸和熊果酸的植物而言很难分离；紫外吸收较弱，检测困难，因此高灵敏度检测方法的建立十分必要；齐墩果酸和熊果酸结构复杂，国内外主要从植物中提取，后期进行化合物的合成和深度开发利用具有重要潜力价值。