黑枣果酒发酵过程主要成分变化规律及香气成分分析

昝立峰，杨香瑜，陈江魁，殷春燕

（邯郸学院生命科学与工程学院，河北省高校冀南太行山区野生资源植物应用研发中心，河北邯郸056005）

黑枣，学名君迁子（Diospyros lotus L.），属于柿树科（Ebenaceae）柿属（Diospyros），落叶乔木[1-2]。主要分布于中国北方地区，河北的涉县、赞皇，山西的平顺、左权，山东的邹平、淄博，湖南的洞口等地均有成片的栽培，其中河北涉县无核黑枣种植面积达2.5 万余亩，每年可产黑枣7 000 多吨，但因缺乏相应的深加工技术，大量果实无人采摘，造成了资源浪费。无核黑枣果酒的研制为黑枣资源的开发利用提供了有效的途径[3-4]。黑枣入脾胃经，能补中养气、养血、安神及明目，多用于补血和作为调理药物，对贫血、血小板减少、肝炎、乏力、失眠有一定的疗效[5-7]。

无核黑枣含有丰富的营养成分，尤其是还原糖、果胶、维生素、氨基酸的含量极为丰富，是研制多种食品、饮料、果酒、保健品的理想原料[8-9]。同时黑枣中含有大量的多酚类化合物，包括没食子酸、没食子酸甲酯、倍酸甲酯、鞣花酸、单宁酸、山萘酚、槲皮素、杨梅素及其衍生物等，这些多酚化合物具有良好的抗氧化、抗肿瘤、镇静和抑制HIV-1 病毒作用[10-13]。本试验分析河北涉县产无核黑枣果酒发酵过程中主要营养成分的变化规律，同时对该工艺条件下黑枣果酒香气成分进行分析，以期为发酵型黑枣果酒的进一步开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无核黑枣于2018 年11 月采自河北省涉县井店镇；安琪果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（酶活力10×104U/g）：河南臻玉实业有限公司；柠檬酸（食品级）：潍坊英轩实业有限责任公司；白砂糖：北京康普汇维科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BioFlo/CelliGen115 发酵罐：New Brunswick Scientific 公司；PHS-3E pH 酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；PAL-1 数显折射仪、PAL-33S 酒精浓度计：厦门森态仪器仪表有限公司；MKJ-J1-4 型实验室微波炉：青岛迈威微波技术应用有限公司；CLARUS 680气相色谱-质谱联用仪：Perkin Elmer 公司。

1.3 方法

1.3.1 黑枣果酒发酵工艺流程

果实精选→清洗→切片→热水浸提→果胶酶处理→调糖→调酸→高温灭菌→接种发酵→后发酵→澄清过滤→灌装→检验→成品

1.3.2 操作要点

1）黑枣汁制备：将无核黑枣切成1 mm～2 mm 的薄片，称取100 g 于烧杯中加入纯水500 mL，置于微波炉中在功率为400 W 条件下微波处理5 min，然后于85 ℃下浸提得到黑枣汁，降温至50 ℃～55 ℃，添加0.2%果胶酶保温2 h。

2）调糖、调酸：过滤后的黑枣汁用白砂糖将可溶性固形物含量调到20%，柠檬酸调节pH 3.5。

3）主发酵：向250 mL 锥形瓶中加入100 mL 黑枣汁，在黑枣汁中加入0.2 %安琪黄酒高活性酵母，在27 ℃条件下恒温发酵9 d。

4）后发酵：主发酵结束后，将酒脚分离，置于10 ℃后发酵30 d。

5）澄清：用0.2%的硅藻土澄清，过滤。

1.3.3 测定方法

糖度测定：数显折射仪进行测定；酒精度测定：酒精浓度计测定发酵液的蒸馏液中的酒精度；还原糖含量按照NY/T 1508-2017《绿色食品果酒》中的方法测定[14]。

参考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]，可溶性固形物的测定采用折光仪法；总酸的测定采用酸碱滴定法；脂肪的测定采用酸水解法；蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法；还原糖的测定采用斐林试剂法；VC的测定采用2，6-二氯靛酚滴定法；多酚的测定采用福林酚法。

1.3.4 气相色谱-质谱联用仪（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）分析

将黑枣果酒用GC-MS 进行成分分析。参考文献[16]，色谱条件：色谱柱为HP-1（30 m× 0.25 mm ×0.25 μm），载气为氦气，流速 1.2 mL/min；初始柱温为40 ℃，保持 3 min；以 20 ℃/min 的速率升温到 240 ℃，保持 10 min；进样量 1 μL，分流比为 20 ∶1。质谱条件为EI 离子源，源温度为50 ℃，接口温度为50 ℃，电子能量为70 eV；质量扫描范围为15 Da～500 Da。

1.3.5 成品质量

在1.3.2 工艺流程下发酵无核黑枣果酒，黑枣果酒成品的质量指标如下：

感官指标：颜色呈深红色，澄清透明，无悬浮物及沉淀物；有淡淡的黑枣香气，与酒香协调，无异味；酒体醇厚丰满，酸甜适口。

理化指标：酒精度：11.8%vol；可溶性固形物含量8.55%；还原糖含量1.32g/L；总酸含量3.25%。

微生物指标：细菌总数≤50 cfu/mL；大肠菌群≤3 MPN/100 mL；致病菌未检出。

产品质量符合国家标准。

2 结果与分析

黑枣果实中营养成分的含量如表1 所示。

2.1 发酵过程中可溶性固形物含量的变化

黑枣果酒在发酵过程中可溶性固形物含量的变化如图1 所示。

表1 黑枣果实的营养成分含量[8]Table 1 The contents of nutuitional composition from date plum fruit

图1 黑枣果酒发酵过程中可溶性固形物含量变化Fig.1 The change of soluble solids in fermentation process of date plum fruit wine

从图1 可以看出，在发酵过程中，可溶性固形物含量逐渐下降。在黑枣果酒发酵最初阶段，酵母菌活性较好，大量消耗了试验中加入的蔗糖和黑枣本身所含的糖分。随着时间的推移，酵母菌活性不断下降，可溶性固形物含量缓慢下降，直至发酵结束。

2.2 发酵过程中还原糖含量的变化

发酵过程中还原糖含量的变化如图2 所示。

图2 黑枣果酒发酵过程中还原糖含量变化Fig.2 The change of reducing sugar in fermentation process of date plum fruit wine

从图2 可以看出还原糖含量的变化整体呈下降趋势，发酵1 d～3 d 下降速度较快，被消耗的还原糖主要用于酵母菌的生长繁殖，而生成的酒精相对较少。但是在接下来的第3 天到第5 天，还原糖含量反而略有增加，可能因为发酵液中的一些蔗糖和多糖被水解成还原糖而使其含量升高。之后随着酵母菌的利用，还原糖含量又呈急剧下降趋势，此时还原糖被酵母转化形成酒精，直至发酵结束，黑枣果酒中的还原糖含量降至发酵最低水平。

2.3 发酵过程中酒精度的变化

黑枣果酒在发酵过程中酒精度与发酵时间的关系如图3 所示。

图3 黑枣果酒发酵过程中酒精度变化Fig.3 The change of alcoholicity in fermentation process of date plum fruit wine

在发酵过程中，果汁中的还原糖在酵母菌的作用下转化为酒精。由图3 可知，在发酵的前3 天，由于酵母菌的大量繁殖，糖分主要用于菌种的生长，酒精度增加相对缓慢。在发酵的第4 天到第7 天，发酵液中形成大量的乙醇，酒精度快速上升，发酵过程中表面有大量的气泡产生。而第8 天以后，发酵趋于平缓，酒度缓慢上升，酒精发酵基本结束。

2.4 发酵过程中总酸含量的变化

发酵过程中总酸含量与发酵时间的关系如图4所示。

图4 黑枣果酒发酵过程中总酸含量变化Fig.4 The change of total acid in fermentation process of date plum fruit wine

从图4 中可以看出，总酸含量在发酵的前5 天呈现一个上升趋势，酵母菌利用黑枣中还原糖以及加入的蔗糖进行发酵，糖的降解会通过戊糖磷酸途径（hexose monophophate pathway，HMP） 等其他方式进行，在这些途径中会产生乳酸、柠檬酸等一些有机酸[17]，因此，在发酵过程中总酸含量逐渐上升，这样有利于抑制其它杂菌的生长。随着发酵的进行，酵母菌活性逐渐下降以及糖含量逐渐下降致使有机酸的合成减少，有机酸和酒槽、单宁、色素等其它物质的结合，维持在一个比较稳定的水平，并略有下降，这些与其他果酒发酵过程中的规律是一致的。

2.5 发酵过程中蛋白质含量的变化

发酵过程中蛋白质含量的变化如图5 所示。

图5 黑枣果酒发酵过程中蛋白质含量变化Fig.5 The change of protein in fermentation process of date plum fruit wine

由图5 可知，在发酵1 d～3 d 内，蛋白质含量没有下降，3 d 后蛋白质含量呈现明显下降趋势，7 d 后发酵趋于稳定。蛋白质含量的下降，一是由于发酵过程中酵母菌消耗蛋白质作为氮源，二是由于发酵过程中大分子的蛋白与其他物质，如单宁等结合生成沉淀。

2.6 发酵过程中脂肪含量的变化

发酵过程中脂肪含量的变化如图6 所示。

图6 黑枣果酒发酵过程中脂肪含量变化Fig.6 The change of fat in fermentation process of date plum fruit wine

由图6 中可以看出，在发酵过程中脂肪含量逐渐下降。黑枣汁中的脂肪在发酵过程中，首先被酵母菌中的脂肪酶作用，分解成甘油和脂肪酸。甘油分解果酒中的单宁，提升果酒的品质和口感，去除苦涩味。脂肪酸受到酵母菌的氧化作用而生成低级脂肪酸。脂肪酸是形成酯的前体物质，酯与高级醇一起形成黑枣酒特有的芳香味，因此脂肪含量随发酵时间的延长而降低。

2.7 发酵过程中VC含量的变化

黑枣果酒发酵过程中VC含量与发酵时间的关系如图7 所示。

图7 黑枣果酒发酵过程中VC 含量变化Fig.7 The change of vitamin C in brewing process of date plum fruit wine

无核黑枣中VC含量较高，VC属己糖衍生物，存在还原型（抗坏血酸）与氧化型（脱氢抗坏血酸）两种结构形态，还原型VC（抗坏血酸）在有氧和无氧条件下均可分解[18]。本文采用2，6-二氯靛酚法测定还原型VC，VC含量的多少是衡量果酒营养价值的重要指标。从图7 可以看出，黑枣酒发酵过程中VC含量逐渐下降，最后趋于稳定。这是因为随着发酵时间的延长，发酵液中的VC被有氧或无氧分解。

2.8 发酵过程中多酚含量的变化

发酵过程中多酚含量与发酵时间的关系如图8所示。

图8 黑枣果酒发酵过程中多酚含量变化Fig.8 The change of polyphenol in brewing process of date plum fruit wine

从图8 可以看出，在黑枣酒发酵初期多酚的含量略有增加后有所下降，7 d 后趋于平稳。可能是在发酵初期，由于柠檬酸的加入，使溶液中的酸度增大，在酸性溶液中更有利于多酚从细胞中溶出。但是随着发酵的进行，多酚发生氧化或者与蛋白质结合，从而使多酚的含量又逐渐降低后趋于稳定。黑枣果酒的涩味就是由多酚引起的。多酚类物质具有抗氧化、增强免疫功能、抗癌、抗衰老、调节毛细血管、抗菌、消炎、抗病毒、降血压、降血脂、抗血栓等生物学作用[19]。果酒中的多酚类物质赋予果酒一定的颜色，同时赋予果酒醇厚丰满、结构稳定、后味悠长的特点，还可以提高酒的耐贮存和抗氧化能力，因此它是构成果酒感官品质的重要因素之一[20]。

2.9 黑枣果酒的香气成分分析

黑枣果酒GC-MS 所得到的总离子流图见图9。

图9 黑枣果酒香气成分GC-MS 总离子流色谱图Fig.9 GC-MS total ion chromatogram of aroma components from date plum fruit wine

图9 中峰形、离子丰度和分离度均较好，满足分析的要求。将分离得到的单组份色谱峰对应的质谱图与NIST11 谱库中质谱图进行检索匹配，分离得到的所有组分对应质谱检索正负匹配较高的化合物鉴定结果列于表2 中。

从无核黑枣果酒香气成分中共鉴定出匹配度较高的18 种成分，包括烷烃类物质9 种、酯类物质8 种和1 种羟胺物质，结果发现该工艺条件下果酒的主要香气成分为烷烃类和酯类物质，其它类物质相对较少。酯类物质也是酵母在发酵过程中的代谢产物，在无核黑枣果酒的香味方面发挥着重要的作用，如黑枣果酒中的己酸乙酯是浓香型果酒的主体香气，乙酸乙酯是果酒的基础芳香物质，是最重要的主体酯类，其它酯类物质也在不同程度上影响着果酒的香味。

表2 无核黑枣果酒香气成分分析Table 2 Analysis of aroma components from date plum fruit wine

3 结论

在以河北涉县产无核黑枣为原料，发酵果酒过程中可溶性固形物、还原糖、蛋白质、脂肪、VC的含量随着发酵时间的变化而降低，而酒精度、总酸的含量却随着发酵时间的延长而上升，在发酵初期多酚含量略有增加，随后缓慢下降并保持稳定的水平。该工艺条件下，涉县无核黑枣果酒中酯类和烷烃类物质构成香气成分的主体，其它成分含量相对较少，赋予了黑枣果酒主要香气特征。