菌株和培养基质对虫草菌质主要营养成分和活性成分的影响

杨宗渠，李长看，雷志华，曲金柱，李坤陶，孔庆寒，罗青

（1.郑州师范学院生命科学学院，河南郑州450044；2.河南省涉鸟故障工程技术研究中心，河南郑州450044；3.郑州师范学院生物物种资源研究中心，河南郑州450044）

冬虫夏草是我国特有的名贵中药资源，是由冬虫夏草菌（Cordyceps sinensis）侵染鳞翅目蝙蝠蛾幼虫后发育而成的由子座和菌核组成的菌体，具有补肺益肾、止血、化痰等功效。冬虫夏草含有腺苷、虫草素、虫草多糖、虫草酸、甾醇类物质，及多种氨基酸、维生素和矿物质元素[1]。现代医学研究表明，冬虫夏草有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗衰老、降血压、调节内分泌、提高免疫力、镇静、抗心肌缺血以及调节心率等功效[2]。冬虫夏草的生长对寄主和环境条件的要求非常严苛，主要生长在高海拔雪域地区，产量很低。市场对冬虫夏草的需求量日益增加，价格飙升，造成对冬虫夏草的肆意采挖，使这一珍贵的野生物种资源濒临灭绝。在冬虫夏草人工培育技术尚未成熟的情况下，通过发酵法生产冬虫夏草菌丝体，以菌丝体活性成分替代天然冬虫夏草的药用价值受到人们的关注[3]。王尊生等[4]分析了冬虫夏草菌丝体固体发酵粉的化学成份，指出虫草发酵粉中3′-脱氧腺苷，甘露醇的含量明显高于冬虫夏草，其它化学成份和冬虫夏草相应成份基本一致。陈建国等[5]对冬虫夏草菌丝体进行了安全性毒理学评价，证实冬虫夏草菌丝体属无毒级。韦会平等[6]用蛹虫草为发酵菌株、大米为基质生产虫草素，经过约13 d的培养，培养基中虫草素达到0.60%，比传统液体发酵方法的最高产量高出近2 倍。吴彩琴等[7]以豆粕和米糠为培养基质，采用固体发酵生产冬虫夏草多糖，在适宜的工艺条件下，菌质中多糖含量达到16.991 mg/g。由于试验菌株和发酵基质的不同，文献报道的固体发酵工艺条件和活性成分产率差别较大。本文以小麦为发酵基质，通过固体发酵培养虫草菌丝体，分析菌质中活性成分和主要营养成分的含量，从而找出活性成分含量高的虫草菌株和固体培养基质，为虫草固体发酵提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

试验的虫草菌株分别由广东省微生物研究所和河南农业大学提供，编号分别为ZNB2.1 和ZNB2.2。

1.1.2 试剂

葡萄糖：天津市天力化学试剂有限公司；苯酚：天津市北联精细化学品开发有限公司；浓硫酸：广州万从化工有限公司；氯化钙：无锡市亚泰联合化工有限公司；碘：天津市津北精细化工有限公司；二甲基亚砜（分析纯）：天津市申泰化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备

LDZX-50FB 型高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；DH-420 型电热恒温培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；TU-1901 紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；Resesrch plus 移液器：德国Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基质的制备

用清水将麦粒清洗2 遍，浸泡12 h 后捞出，放入锅中加热直至锅内水沸腾，煮沸20 min，待麦粒充分吸水膨胀但不开裂时捞出，沥去多余的水分。然后将麦粒摊晾至麦粒表面无水分，配制成5 种培养基质。A：小麦100%；B：小麦50%、燕麦30%、玉米20%；C：小麦50 %、燕麦30 %、糙米 10 %、谷子10 %；D：小麦50%、燕麦30%、荞麦5%、高粱 5%、玉米10%；E：小麦50%、燕麦30%、糙米5%；玉米8%、高粱7%。将不同配方的培养基质分装于500 mL 菌种瓶中，每瓶装干料150 g，121 ℃下杀菌2 h。每个配方4 次重复。

1.2.2 接种和培养

在无菌条件下，将虫草母种接种到经过高压杀菌的培养基质上，接种后的菌种瓶置于25 ℃的恒温培养箱中进行避光培养。

1.2.3 虫草多糖含量测定

1.2.3.1 葡萄糖标准曲线的制作

取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖20 mg 放入小烧杯中，加蒸馏水溶解，然后转至500 mL 容量瓶中，加水定容，即为40 μg/mL 的葡萄糖标准液。分别取40 μg/mL的葡萄糖溶液 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL至编号为0～8 的9 支20 mL 具塞试管中，各加蒸馏水1.8 mL，6%的苯酚溶液1.6 mL 以及浓硫酸7.5 mL，摇匀，静置 10 min，再摇匀，（23±2）℃放置 20 min 后，每组设3 个平行样品，用紫外分光光度计在490 nm 波长测定样品吸光度。横坐标为葡萄糖微克数，纵坐标为吸光度，用excel 软件制作葡萄糖标准曲线。

1.2.3.2 样品提取液的制备

精确称取烘干粉碎的菌质样品放入100 mL 烧杯中，分别加入50 mL 的蒸馏水，85 ℃水浴加热浸提2 h，连续提取3 次。合并滤液用蒸馏水定容至100 mL。

1.2.3.3 去淀粉处理

将固体菌质用粉碎机打成细末状，然后称取样品粉末放入50 mL 烧杯中。向烧杯中分别添加4 mL 3 mol/L 的CaCl2溶液，然后将烧杯放入85 ℃的水浴锅中加热，用玻璃棒搅拌10 min 促进溶解，使淀粉糊化。取出烧杯，再分别向烧杯中添加15 mL 6 mmol/L 的I2-DMSO 溶液，溶解淀粉，放入85 ℃的恒温水浴锅中，加热30 min。将烧杯里的样品倒入离心管中，放入离心机中，转速3 000 r/min，离心5 min。取出离心管，倒掉上清液，取出离心管底部的沉淀放入烧杯中，向烧杯中分别添加4 mL 的CaCl2溶液，置85 ℃的恒温水浴锅里，进行第2 次去淀粉，再制备样品提取液，提取，定容，稀释2 倍，装于50 mL 容量瓶中。

1.2.3.4 样品多糖含量的测定

分别从50 mL 的容量瓶中用移液枪取0.2 mL 提取液至10 支20 mL 具塞试管中，另准备一支20 mL 具塞试管作为对照，向11 支具塞试管中加蒸馏水补至1.8 mL。分别加1.6 mL 的6%的苯酚溶液和7.5 mL 的浓硫酸至20 mL 具塞试管中，摇匀，静置10 min；再次摇匀，（23±2）℃放置 20 min 后，于 490 nm 测定吸光度。

样品多糖含量/（mg/g）=[提取液的多糖含量（μg）×稀释倍数×100]/[样品干重（g）×1 000]

1.2.4 虫草素含量测定

称取2.00 g 粉碎的样品于离心管中，加入15 mL的蒸馏水，在50 ℃水浴中超声60 min，离心取上清液；再向离心管中加入5 mL 的蒸馏水，混合均匀，水浴超声30 min，离心取上清液；然后再加入5 mL 蒸馏水，混匀水浴超声30 min，离心取上清液，将3 次离心的上清液合并，用蒸馏水定容25 mL，过滤膜进样测定，若浑浊再次离心后过滤膜。色谱柱为C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温 35 ℃，流动相为水与乙腈体积比为 90 ∶10，流速 1.0 mL/min，进样量 20 μL，波长 260 nm。

1.2.5 虫草酸含量测定

提取过程与虫草素测定相同。色谱柱C18（4.6 mm×250mm，5μm），柱温35℃，流动相为水，流速0.6 mL/min，进样量20 μL，检测器为示差检测器。

1.2.6 营养成分含量测定

1）还原糖：GB/T 5009.7-2016《食品中还原糖的测定》直接滴定法。

2）蛋白质：GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法。

3）脂肪：GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》酸水解法。

4）淀粉：GB/T 5009.9-2016《食品中淀粉的测定》酸水解法。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

测定葡萄糖含量，标准曲线如图1 所示。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，得到回归方程y=0.004 9x+0.021 9，R2=0.986 6。

图1 葡萄糖含量标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose content

2.2 不同菌质中虫草多糖含量

培养基质是虫草菌丝体生长的基础，基质的成分和原料配比直接影响菌丝的生长，进而影响次生代谢产物的形成。不同菌质的虫草多糖含量见表1。

表1 不同菌质的虫草多糖含量Table 1 Cordyceps polysaccharide content of different fungal substance

由表1 可以看出，2 个菌株在5 种不同配方的培养基质上的多糖产率不同，菌株ZNB2.1 在B 和C 培养基质中的多糖产率较高，分别为5.119%、5.037%，A培养基质中的多糖含量最低，仅为3.578 %。菌株ZNB2.2 在E 培养基质中的多糖含量最高，达到4.853%，在C 培养基质中的多糖含量最低，为2.799%。由表1还可知，菌株ZNB2.1 在5 种培养基质中多糖含量的平均值大于菌株ZNB2.2，说明ZNB2.1 产生多糖的能力大于ZNB2.2。

2.3 去淀粉处理的多糖含量的影响

据文献报道，测定菌质的多糖含量时，菌质中的剩余淀粉，特别是被虫草菌丝降解而产生的小分子淀粉，会使多糖的测定值提高，增大试验误差[8]。为减小菌质中淀粉对虫草多糖测定的干扰，采用二甲基亚砜去除残留淀粉后，再测定虫草多糖含量。样品经去淀粉处理后，虫草多糖含量测定结果见表2。

表2 去淀粉后的菌质中虫草多糖含量Table 2 Cordyceps polysaccharide content of fungal substance after starch removal

由表2 可知，去淀粉后10 个菌质样品的多糖含量都比去淀粉前降低，ZNB2.1 菌株5 种培养基质的菌质多糖含量由3.578 %～5.119 %降至2.588 %～4.188%，ZNB2.2 菌株5 种培养基质的菌质多糖含量则由2.799%～4.853%降至2.094%～3.924%。

5 种培养基质中，ZNB2.1 在B 培养基质中产生的多糖最多，菌质多糖含量最高，为4.188%，在A 培养基质中形成的多糖最少，菌质多糖含量最低，为2.588%。ZNB2.2 在E 培养基质中的多糖产率最高，菌质多糖含量达到3.924 %，C 培养基质中的多糖含量最低，为2.094%。由表 2 还可知，去淀粉后，ZNB2.1 在 5 种培养基质菌质的多糖含量平均值依然大于ZNB2.2。无论是去淀粉前还是去淀粉后，ZNB2.1 在5 种培养基质中多糖含量的平均值都大于菌株ZNB2.2。

2.4 不同菌株的菌质中主要营养成分及活性成分的影响

发酵前后基质的营养成分变化和活性成分含量见表3。

表3 发酵前后基质的营养成分变化和活性成分含量Table 3 Changes of nutritional components and contents of active components in substrates before and after fermentation

虫草菌丝体在生长过程中，从培养基质中吸取营养，完成生长代谢过程，产生活性成分，同时使基质的营养成分发生变化。将2 个菌株分别接种到基质E上，发酵结束后测定菌质的主要营养成分及活性成分含量，可以发现基质经过2 个虫草菌株发酵后，其营养成分发生了变化，均表现为还原糖含量增高，淀粉和蛋白质含量降低。ZNB2.2 菌株在发酵过程中，产生虫草素和虫草酸，菌质中生活性成分虫草素和虫草酸的含量分别达到207.4 mg/kg 和22.1 g/kg，而ZNB2.1 菌质中未检测到虫草素和虫草酸。说明虫草菌丝体固发酵可产生虫草素和虫草酸，产生活性成分的能力因菌株而异。

3 结论与讨论

菌株ZNB2.1 和ZNB2.2 分别在基质B 中和基质E中的多糖产率最高，ZNB2.1 产生虫草多糖的能力大于ZNB2.2。对菌质样品进行去淀粉处理，可减小残留淀粉对虫草多糖测定的干扰。基质经过虫草固体发酵后，还原糖含量增高，淀粉和蛋白质含量降低。ZNB2.2 菌株的菌质中虫草素和虫草酸的含量分别达到207.4 mg/kg和22.1 g/kg，而ZNB2.1 菌质中未检测到虫草素和虫草酸。虫草菌丝体固发酵产生活性成分的能力因菌株而异，综合考虑虫草多糖、虫草素和虫草酸的产率，虫草固体发酵宜选用ZNB2.2 菌株和基质E。

庄毅等以槐耳菌为发酵菌种、中药材黄芪为发酵基质进行双向固体发酵，即基质为槐耳菌生长提供所需营养，槐耳菌产生新的活性成分，而基质的原有成分因真菌分泌的酶的作用发生变化，槐耳菌丝体、活性成分和黄芪基质共同构成药性菌质，从而产生新的性味功能，具有比该真菌或药性基质本身或两者简单相加更好的药效[9]。本研究选用虫草为发酵菌种、小麦为发酵基质进行双向固体发酵，虽然基质中的淀粉和蛋白质等营养成分被菌丝分解而减少，但菌质中生成了虫草的活性成分——虫草多糖、虫草素和虫草酸，菌质可用于开发营养保健食品。该双向固体发酵研究为小麦的精深加工提供了一条新途径。薛俊杰等报道，虫草素的分泌与菌株特性有密切关系，并不与菌株的长势直接相关[10]。孙军德等通过5 个虫草菌株的菌丝生长速率和培养基中活性物质含量的对比研究，发现不同虫草菌株的菌丝生长速率、虫草多糖和虫草素地含量不同[11]。刘艳芳等对19 个虫草属菌株的菌丝体中活性成分进行了分析，结果表明不同菌株菌丝体虫草素含量差异显著[12]。本试验中不同虫草菌株产生活性成分的能力不同，与文献[10-12]的研究结果一致。另据报道，虫草菌丝的培养条件直接影响菌质中活性成分的含量，为提高虫草多糖、虫草素和虫草酸等活性物质的产率，需要对虫草双向固体发酵的培养条件进行更深入的研究。