河北省不同地区、不同品种及生长时期桑叶中总黄酮含量分析

高林森，温吉更，李亚丽，郭烨

（河北省农林科学院农业信息与经济研究所，河北石家庄050051）

桑叶中含有多种功能性成分，开发利用价值很广。近年来，学者们对桑叶进行研究，发现桑叶中含有黄酮类、生物碱、植物甾醇等物质，且多糖、氨基酸、维生素等含量丰富[1]。桑叶黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的自由基，抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生[2-6]。

但是桑叶中黄酮的含量与桑品种、产地、季节以及叶位等都有显著相关性。刘利等[7]研究表明，长穗桑、华桑叶片总黄酮含量分别为63.92、61.17 mg/g，极显著高于其它桑种，白桑则极显著低于其它桑种。俞燕芳等[8]的试验结果表明，产地不同桑叶总酚、总黄酮的含量及其体外抗氧化活性有显著差异，其中江西永新地区“农桑14 号”总酚和总黄酮的含量最高。张丽丽等[9]研究发现，不同品种、不同生长期桑叶中的生物碱类、黄酮类成分含量差异较大，黄酮类成分的含量变化较小，10 月份之后亦呈下降趋势。

近些年来大健康观的地位与意义正在不断提升[10]，河北省也在大力对药食同源名单上特色果树的医学功能展开研究[11-14]，桑树不仅是河北省的一种特色药食同源果树，而且在河北省的某些地区也有大面积的种植，因此本试验对河北省大面积种植地区的桑叶进行了采摘，并对其总黄酮含量进行了对比分析。为河北省桑叶的产品研发及黄酮的有效利用提供了有力的科研依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

桲椤、冀 2、冀 3、冀 4、湖桑 32 号：承德市；无核大十、黑珍珠、红果2 号、白玉王：邢台市；黑珍珠、台湾长桑：沧州市；黑珍珠、桂花蜜、红果2 号、白葚子：衡水市。桑叶样品采摘时间为6 月～9 月。

1.1.2 试验药品

硝酸钠、镁粉、硝酸铝：山东西亚化学工业有限公司；芦丁：上海斯信生物科技有限公司；氢氧化钠：天津市大陆化学试剂厂；乙醇（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备

LGJ-18 冷冻干燥箱：北京松源华兴科技发展有限公司；KQ-500DB 超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DK-98-II 恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；RS2200QUC 超纯水机：上海乐枫生物科技有限公司；UVmini-1240 分光光度计：SHIMADZU 岛津有限公司；REVCO EXF-80 ℃冰箱：美国 REVCO EXF 公司。

1.2 方法

1.2.1 桑叶的处理

1）冷冻干燥：以承德产区桲椤桑为试验样品，称取鲜桑叶100 g 左右，在-80 ℃冰箱内预冻1 h，再进行真空冷冻干燥，冷阱温度-50 ℃左右，真空度0.025 MPa，冷冻干燥6 h。干燥后的桑叶粉碎待测[15]。

2）自然晾干：以承德产区桲椤桑为试验样品，称取鲜桑叶100 g 左右，放于室温20 ℃下晾干，将干燥后的桑叶粉碎待测[16]。

3）真空干燥法：以承德产区桲椤桑为试验样品，称取桑叶100 g 左右平铺于托盘中，于真空干燥箱中干燥。干燥条件分别为65 ℃、100 min 将干燥后的桑叶粉碎，待测[17]。

将处理后的桑叶用粉碎机打成粉末，过40 目筛子，备用。准确称取1.00 g 桑叶粉放于具塞试管，溶于70 %的乙醇，料液比 1 ∶40（g/mL），超声混匀，放于70 ℃恒温水浴锅下恒温水浴提取2 h，过滤去除提取液的杂质，抽滤浓缩到20 mL。

1.2.2 总黄酮含量的检测

取1 mL 待测提取液于试管中，加入5%NaNO3500 μL 后摇匀，静置6 min。然后加入10%Al（NO3）3500 μL，静置 6 min。最后加入 4%NaOH 1 mL，用 70%乙醇定容至5 mL，静置15 min 后在510 nm 波长下测吸光度，用70%乙醇作为空白对照。

1.2.3 芦丁标准曲线的绘制

准确称300.0 mg 芦丁，用70%酒精定容到100 mL，超声混匀，得到最初3 mg/L 标准溶液，然后把最初标准溶液稀释，得到中间标准溶液，中间标准浓度为2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L。然后吸取 1 mL 一系列标准溶液于试管中，加入5%NaNO3500 μL 后摇匀，静置6 min。然后加入10%Al（NO3）3500 μL，静置6 min。最后加入4%NaOH 1 mL，用70%乙醇定容至5 mL，静置15 min后在510 nm 波长下测吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。得到了芦丁浓度Y 与吸光度值x 的关系曲线的回归方程为：Y=0.127 5x+0.031 4，相关系数R2=0.993 6。

2 结果与讨论

2.1 不同生长地区桑叶中总黄酮含量比较

通过查找大量文献和实地调研[18-20]，了解到河北省大面积栽桑树的地区有邢台、泊头、献县、衡水和承德等地，由于地区和气候的不同，泊头、献县、衡水和邢台主栽桑树的品种为黑珍珠，另外为了桑果的收益会栽种其它品种桑树，比如桂花蜜、红果二号、台湾长桑（南方桑树品种）和白葚子等，而承德地区栽种的桑树品种较多，其中适应性较广的为桲椤、冀3、冀2、冀4和湖桑32 等桑叶。因此对衡水、献县、泊头和邢台产区的黑珍珠桑叶和承德栽种较多的桲椤桑叶，总黄酮含量进行了对比分析（n=5），试验过程中桑叶的采摘日期相差不超过3 d，桑叶干燥方式均为冷冻干燥。结果见图1。试验结果表明，不同产地总黄酮含量存在差异，其中承德产地桲椤桑总黄酮的含量最高，为32.65 mg/g，其次是衡水、献县、泊头和邢台产地的黑珍珠桑叶，分别为 30.25、29.54、29.26、27.02 mg/g。

图1 不同产地总黄酮含量Fig.1 Total flavonoid content in different producing regions

2.2 不同品种桑叶中总黄酮含量比较

由于承德产区桑叶品种较多，且桑叶中总黄酮含量比其他产区都高，因此以承德产区桑叶为例，对不同品种桑叶中总黄酮含量进行了对比分析。对承德产区桲椤、冀3、冀2、冀4 和湖桑32 这6 个品种春桑叶中的总黄酮含量进行了测定，结果见图2，其中总黄酮含量最高的是桲椤桑叶，含量为29.36 mg/g，其次是冀3、冀2、冀4 和湖桑32，含量分别为27.84、26.69、26.12、22.47 mg/g（n=5）。

图2 不同品种总黄酮含量Fig.2 Total flavonoids in different varieties

2.3 不同生长时期桑叶中总黄酮含量比较

选择桑叶品种较多的承德产区桑叶，分析不同月份下桑叶中总黄酮含量的差异。本试验分别采摘了承德产区 6、7、8 和 9 月份桲椤、冀 3、冀 2、冀 4 和湖桑32 五大品种的桑叶，测得的总黄酮含量见表1。

表1 不同季节、不同品种桑叶总黄酮含量Table 1 Total flavonoids in mulberry leaves of different seasons and varieties

由试验结果可知，不管哪个品种的桑叶，由于季节的原因，总黄酮的含量变化较大，其中承德夏季刚长出的幼嫩叶子总黄酮含量最高，随着生长时期的延长，总黄酮含量会降低，其中桲椤桑六月份总黄酮含量的32.65 mg/g，在九月份降低到了27.22 mg/g，降低了16%。

2.4 不同干燥方式桑叶中总黄酮含量比较

不同的干燥方式对桑叶中总黄酮含量会产生一定的影响。

干燥方式对桑叶总黄酮的影响见表2。

由试验结果可知，冷冻干燥的桑叶总黄酮含量最高，为30.30 mg/g，有利于桑叶长期保存。其次是自然晾干，含量最低的是烘干方式。可能是因为黄酮属于热敏性物质，温度越高对黄酮的破坏程度越大，黄酮的损失就越大。

表2 干燥方式对桑叶总黄酮的影响Table 2 Effect of drying method on total flavonoids in mulberry leaves

3 结论

本试验结果表明，河北省主栽的桑树，在不同生长地域、不同品种、不同生长时期和不同干燥方式桑叶下总黄酮的含量存在差异。其中邢台、泊头、献县、衡水产区的种植最多的黑珍珠桑黄酮含量，相比于承德的桲椤桑少。且桲椤桑在桲椤、冀3、冀2、冀4 和湖桑32 五大品种黄酮含量也是做高的为29.36 mg/g。且一般来说春季采摘的桑叶黄酮含量高于秋季的。

对于桑叶的处理方式，其中冷冻干燥法制备的桑叶色泽最好，与新鲜桑叶最为接近，总黄酮的含量也最高，平均含量为30.30 mg/g，真空干燥法制备的桑叶总黄酮含量最低，为25.14 mg/g，且桑叶的色泽也最差，自然晾干的桑叶的总黄酮含量以及色泽都处于中间状态，相对于冷冻干燥法，自然晾晒不仅成本低，而且操作简便，相对于真空干燥法，自然晾晒的桑叶总黄酮含量较高，样品品质较好，更适合于工业化生产。本研究为改善传统的桑叶利用结构和开发桑叶的新用途，以及桑叶总黄酮的有效利用提供了科学依据。