单细胞测序技术及其在肝脏疾病研究中的应用

王煜鹏，杨扬，王学军，周喆，王升启

1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.军事医学研究院 辐射医学研究所，北京 100850

肝脏作为中枢代谢协调器，具有广泛的基本功能，包括葡萄糖和脂质代谢的调节、蛋白质合成和胆汁合成。此外，当肝脏受到损伤后，具有一定程度的自我更新和修复能力。近几十年来，肝脏疾病一直是全世界最为关注的人类健康问题之一，研究发现在全球范围内肝脏疾病的发生率和死亡率均呈显著上升趋势[1]。近年来尽管人类在肝病治疗领域取得了较大进展，但因其全球患病率高、长期临床疗效差、致病因素多且临床上常同时出现多种表型，所以目前在提高肝病患者治愈率及生存率方面仍然收效甚微[2]。因此，迫切需要提高对各种肝病复杂性的认识，以帮助获得更准确的疾病亚型，用于个性化治疗。

细胞是人体中最小的结构和功能单元，每个功能单元都有不同的来源和背景，它不仅存在于不同生物体中，而且存在于同一个生物体的不同器官和组织中[3-4]。肝脏中的细胞种类较为丰富，包括肝细胞、肝内皮细胞、星状细胞、胆管细胞以及各种免疫细胞。在肝炎、肝纤维化或肝癌等肝脏疾病的发生发展过程中，即使同一类细胞的基因组、转录组、蛋白质组学等都会发生变化甚至会分化产生新的细胞亚型，导致疾病的进一步恶化和转变。传统的研究技术和方法往往要从大量细胞中提取DNA、RNA或蛋白质，得到的是这些细胞的整体表征，很多重要的低丰度细胞的显著差异信息会被丢失，这可能会直接影响病情的正确评估和治疗方案的正确选择。

单细胞测序技术作为一项新兴技术，一经推出就受到广泛关注，并在过去几年得到迅速发展。它可以弥补传统研究技术和方法的不足，在单细胞分辨率水平展示肝脏的全面视图，概述肝脏中驻留细胞的特征，特别是提供肝脏免疫微环境的图谱，在理解肝脏细胞发育轨迹、表征组织内细胞异质性、分析基因表达差异方面展现出了前所未有的优势。单细胞测序技术的蓬勃发展为生物学、医学、癌症学等研究领域带来了一场空前革命，为众多可能性打开了大门[5-8]。本文将主要阐述单细胞测序及其在肝脏疾病研究中的应用。

1 单细胞测序方法分类

单细胞测序技术发展至今得到了广泛的拓展和研究，下面对当前已有的单细胞测序方法进行简要综述。

1.1 单细胞基因组测序

单细胞DNA测序（scDNA-seq）作为在单细胞水平上对细胞全基因组进行扩增和测序的一项技术，需要对分离出的单细胞微量基因组进行全基因组扩增（whole genome amplification，WGA）。为了确保无偏倚的高基因组覆盖率，自单细胞测序技术诞生后近20年来，WGA技术发生了几次重大变革。WGA主要有3种方式，即简并寡核苷酸引物聚合酶链反应（degenerate oligonucleotide primer polymerase chain reaction，DOP-PCR）[9]、多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）[10]和基于多个退火和循环的扩增循环（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）[11]。尽管 WGA 可以提高 scDNA-seq的敏感性，但单细胞DNA研究主要聚焦拷贝数变异（CNV），因为准确鉴定CNV要求相当高的敏感性，所以目前仍然是个挑战。

1.2 单细胞转录组测序

单细胞转录组测序通常称为单细胞RNA测序（scRNA-seq），用于解析复杂生物系统中单细胞水平的细胞类型差异和基因表达谱，在定义新的细胞类型、发现新的生物标志物以及分析和理解细胞异质性方面有着独特的优势。单细胞RNA测序比单细胞DNA测序更容易实施，因为每个细胞都包含许多RNA分子，但DNA分子拷贝数却极少[12]。进行常规基因表达分析时，一般选择基因的3'端测序，而当进行免疫克隆以及T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）相关研究时，则应选择5'端测序。5'端测序会进行V（D）J全长片段的组装和注释，对单个T细胞TCR的α和β链序列进行匹配，以及对单个B细胞的BCR轻链和重链序列的匹配，这对于探索适应性免疫系统具有重要意义。

1.3 单细胞DNA甲基化测序

在正常细胞发育过程中，DNA甲基化是许多物种中重要的表观遗传标记，它作为化学或蛋白质标签存在于DNA序列中。这种标签在不改变现有DNA序列的基础上，时刻记录着细胞的发育变化过程，参与决定生物学调控过程的开启或关闭，控制细胞的命运。之前对于DNA甲基化的研究是建立在大量细胞的整体测量上，这掩盖了细胞之间的差异以及一些稀有细胞类型的影响。因此，在单个细胞中测量DNA甲基化的能力可能对理解几个关键的生物学过程（例如胚胎发育、疾病进展和衰老）做出重要贡献[13]。

1.4 单细胞组蛋白修饰测序

组蛋白修饰可调节某些特定DNA区域的亲和力和可及性。为了解析组蛋白修饰在不同细胞中的作用，先后开发了单细胞染色质免疫沉淀测序（single-cell chromatin immunoprecipitation sequencing，scChIP-seq）[14]、测序后单细胞染色质整合标记（single-cell chromatin integration labeling followed by sequencing，scChIL-seq）[15]、靶向性和标签化的单细胞裂解（single-cell cleavage undertargets and tagmentation，scCUT＆Tag）[16]以及单细胞染色质免疫切割然后测序（single-cell chromatinimmune-cleavage followed by sequencing，sc-ChIC-seq）[17]等4种方法。这些先进的单细胞技术可以在一些不能仅通过转录组来分析细胞的情况下，揭示表观遗传异质性的各个方面，有望在癌症基因组学和相关转化研究中得到更多应用。

1.5 单细胞染色质结构测序

染色质结构在胚胎发育、分化及疾病发展中起核心作用。对转座酶核可及的染色质进行单细胞测序（single-cell sequencing for transposase accessible chromatin，scATAC-seq），即是以在功能上鉴定细胞中染色质结构的相关变化为目的的一项解决方案。使用scATAC-seq，让研究者能够通过识别每个细胞中开放染色质位点的基因组位置的变异性，从而洞悉由其他相同的DNA序列产生的细胞间变异性，观察染色质致密化和DNA结合蛋白如何精准调节基因表达，达到补充单细胞DNA和RNA测序获得的DNA拷贝数变异和RNA表达数据的目的，在功能上鉴定癌细胞特定亚群中染色质结构的相关变化是其独特优势[18]。

1.6 单细胞空间转录组测序

在单细胞测序技术发展日益成熟的环境下，基于单细胞转录组测序的单细胞空间转录组测序技术应运而生。它将Visium空间内视技术与单细胞转录组测序相结合，产生了Visium Spatial基因表达解决方案。使用这一方案，可测量组织切片中的总mRNA，并且只需要带有完整组织切片的Visium Spatial玻片作为输入，将细胞中基因的表达无偏离地对应在组织切片上，为我们提供以前无法获得的组织生物学观点。但为了保证mRNA转录本的完整性以及保持组织切片的形态质量，正确的组织处理和制备技术对于此方案极为重要。这一方法的出现，使以往难以解离的组织，以及一些数量稀少且极易发生应激死亡的细胞类型，有了以单细胞水平探索转录组的可能。

2 单细胞测序在肝脏生理功能研究中的应用

肝脏作为代谢和免疫反应发生的主要场所之一，是人体中体积最大的器官。然而，关于组成肝脏及其免疫微环境的细胞知之甚少。因此，以单细胞分辨率展示肝脏的全面视图，概述肝脏中驻留细胞的特征，特别是提供肝脏免疫微环境的细胞图谱，对于了解肝病的发病机理和治疗至关重要。2017年，Halpern等[19]利用单分子荧光原位杂交（single molecule fluorescencein situhybridization，smFISH）与单细胞RNA测序技术相结合，首次对小鼠的整个肝脏单细胞转录组图谱进行了研究，这使人们更充分地意识到肝脏中细胞的高度异质性以及区域特性，在细胞层面上对健康肝脏组织生理加深了理解。之后，MacParland等[20]通过对5个人类新鲜肝组织的分离获得的8444个实质细胞和非实质细胞的转录谱进行单细胞RNA测序，揭示了不同的肝内巨噬细胞群体，即存在2种不同的肝内CD68+巨噬细胞种群，分别具有促进炎症和免疫调节功能。这为更精确地了解肝内巨噬细胞亚群在肝病发生和发展中的作用以及开发新的免疫调节疗法提供了参考。随后，在肝脏的细胞组成仍然知之甚少的情况下，Aizarani等[21]对来自9位人类供体正常肝脏中的细胞进行了单细胞RNA测序，以构建人类肝脏细胞图集。通过分析确定了内皮细胞、枯否细胞和肝细胞先前未知的亚型，揭示了肝细胞和内皮细胞在转录组范围内的区域划分，并发现不同类型的肝细胞可能协同执行基本功能。这份人类肝脏细胞转录组图谱为发现正常和患病的肝脏中以前未知的细胞类型提供了强大的数据支持。针对目前的研究现状，Halpern等[22]在普通单细胞测序基础上开发了配对细胞RNA测序（paired cell RNA sequencing，pcRNAseq），分析肝细胞及相邻肝内皮细胞的基因表达，并利用肝细胞标记基因确定其在组织中的定位，以高空间分辨率解决了肝内皮细胞基因的空间分区模式。同时，Gravina等[23]采用单细胞DNA甲基化组学分析，发现小鼠肝脏内全基因组5-甲基胞嘧啶（5mC）模式具有高度异质性，DNA甲基化模式中的表观突变频率比体细胞突变频率高至少2个数量级。

在对成熟肝脏的生理有了一定了解之后，以单细胞分辨率探究肝脏的发育过程也逐渐取得成果。Su等[24]采用无标记scRNA-seq技术分析了小鼠肝脏发育过程中从胚胎11.5 d到出生后2.5 d的7个时期中随机选择的507个细胞和出生后3.25 d小鼠肝脏中52个Epcam阳性的胆管细胞的综合转录谱，揭示了小鼠肝脏发育的动态轨迹，并且发现细胞间的异质性存在于肝脏发育的各个阶段和病理状态。同样针对肝脏发育，Segal等[25]利用scRNA-seq技术，以单细胞分辨率探索人类胎儿和成年肝脏的转录组，在人类胎儿肝脏中发现了肝胆双能祖细胞（HHyP）的存在，这为胚胎发育、体内平衡或肝脏受损修复过程中人类肝实质组织细胞的起源给出了答案。

3 单细胞测序在肝脏炎症反应和肝损伤研究中的应用

此前的研究表明，炎症反应的发生和发展与免疫细胞的募集和浸润有关，但在慢性疾病期间免疫细胞如何对肝脏中发生的炎症和免疫细胞浸润做出反应还不得而知。Tamburini等[26]使用单细胞RNA测序和多光谱免疫荧光分析，证明了慢性肝病患者的淋巴管丰度增加，并且与纤维化和免疫细胞浸润区域相关。同时，还发现淋巴管内皮细胞（LEC）在慢性肝病发展过程中会加快增殖，以维持组织稳态。但是，当在脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）状态下的氧化型低密度脂蛋白等炎症信号增加时，淋巴功能下降，肝动态平衡受损。

在肥胖相关的非酒精性脂肪肝疾病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）发展为脂肪性肝炎的过程中，肝脏和骨髓中的免疫细胞功能必定会受到影响发生变化。因此，深入表征脂肪肝中免疫细胞的功能适应性就极为必要。Krenkel等[27]利用单细胞RNA测序全面评估了非酒精性脂肪肝疾病期间肝脏和骨髓中髓样细胞的异质性，发现肝和骨髓中存在不同的髓样细胞簇。同时，肝髓样区在NAFLD进展过程中逐渐适应了独特的炎症表型，并且肝脏和骨髓中的髓样细胞具有功能上独特的炎症表型，其典型特征是巨噬细胞和树突状细胞亚群中的炎症钙结合蛋白基因（S100A8/A9）表达下调。这为进一步了解脂肪性肝炎打下了基础。Xiong等[28]对健康和脂肪性肝炎小鼠肝脏细胞进行单细胞RNA测序研究，发现在脂肪性肝炎的肝脏中出现了与脂肪性肝炎相关的巨噬细胞（NASH-associatedmacrophages，NAM），并且其对药理反应高度敏感。将其作为小鼠和人类脂肪性肝炎的标志，是我们了解、治疗和预防脂肪性肝炎的重要理论依据。

肝脏是人体最大的实体器官，肝脏损伤会导致一连串的炎症事件。为了在单细胞水平上更深入了解肝脏受损状态下的转录组信息，Chang等[29]利用单细胞RNA测序探索肝胆汁淤积性损伤期间肝细胞亚型和独特功能，发现肝损伤期间表达细胞外基质基因的肝细胞可能经历了上皮-间质转化，同时，胆汁淤积性肝细胞的4个簇（BDL-2、BDL-3、BDL-4和 BDL-5）以炎症调节、组织修复等不同方式参与了炎症过程。这些结果提供了更多对受损肝中肝细胞独特功能的认识，对肝细胞的未来优化治疗提供了理论依据。肝脏主要的上皮细胞如肝细胞和胆管上皮细胞（biliary epithelial cells，BEC）等在肝损伤再生过程中起重要作用，Pepe-Mooney等[30]使用单细胞RNA测序检查了肝脏组织稳态时和损伤后的胆管上皮细胞和肝细胞异质性，发现稳态时胆管上皮细胞有着显著的异质性，反映了YAP信号依赖性程序的激活，而YAP信号是肝细胞在损伤后重编程为胆管祖细胞所必需的，这种转录特征定义了细胞在体内平衡过程中的动态变化，并且对损伤具有高响应性。

4 单细胞测序在肝纤维化研究中的应用

肝纤维化的发生往往是由于长期炎症以及反复的肝损伤等导致纤维发生和纤维溶解之间的不平衡，形成纤维结节，从而破坏了肝脏结构、再生潜能和肝功能，长时间持续纤维化最终可能会向肝硬化、肿瘤等症状进一步恶化。因此，在单细胞分辨率水平解析肝纤维化状态下的肝脏组织，会为我们理解、治疗和预防肝纤维化提供强大的理论基础。Dobie等[31]使用单细胞RNA测序对健康和纤维化小鼠肝脏中的肝间充质细胞进行测序，揭示了跨肝小叶的星状细胞（HSC）的空间分区，表明阻断LPAR1后会抑制脂肪肝动物模型中的肝纤维化，从而确定了LPAR1为抑制胶原蛋白产生的治疗靶标，同时高精度地解析了驱动肝纤维化的关键胶原生成细胞。同时，Krenkel等[32]将肝纤维化小鼠体内静息的星状细胞和活化的成纤维细胞，与体外培养的成纤维细胞通过单细胞RNA测序进行比较，表征了纤维化状态下星状细胞和成纤维细胞的高度异质性，鉴定了肝纤维化中星状细胞和成纤维细胞亚型的存在。这些研究让我们从单细胞角度对肝纤维化状态下肝脏环境有了新的认识，这可能为未来预防和治疗肝纤维化、肝硬化等疾病提供机会。

5 单细胞测序在肝脏肿瘤研究中的应用

在全球范围内，肝癌是最常见的致命恶性肿瘤[33]，其高异质性、耐药性、增殖转移迅速、免疫微环境复杂等特征一直是造成疾病难以治愈的重要原因。为了了解肿瘤异质性与肿瘤相关的形态学、组织学特征间的关系，Duan等[34]使用单细胞全基因组测序分析了乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染相关肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的男性肿瘤细胞和正常肝细胞，发现特定的HCC可能是单克隆或多克隆来源，起始克隆的早期肝内扩散会导致同步多灶性肿瘤的形成。这些发现强调了肝细胞癌中多种不同的肿瘤进化机制，针对不同的肿瘤模型，需要特定的治疗策略。针对肝细胞癌免疫微环境复杂这一现象，Zhang等[35]结合2种单细胞转录组测序技术，从5个免疫相关位点检测了肝细胞癌的CD45+免疫细胞转录组信息，揭示了各种CD45+免疫细胞类型的动态特性，为我们对肝细胞癌复杂免疫环境的认识增加了新的维度。为了解析癌组织肝转移性的机制，Zhang等[36]对从大肠癌患者体内检测出的肝转移癌组织和邻近组织的样品进行了单细胞测序研究，分析了癌细胞和T细胞群体的动态变化途径以及相关基因的表达与患者存活率的相关性，同时发现Wnt信号通路被激活并促进了粒细胞迁移。这为阐明肿瘤的微环境组成，以及大肠癌肝转移机制铺平了道路。

近年来，逐渐兴起的肿瘤免疫疗法进入大众视线，其关键在于肿瘤浸润淋巴细胞在肿瘤中的分布以及预测其在癌症中可能造成的临床反应。因此，Zheng等[37]对6名肝细胞癌患者的外周血、肿瘤和邻近正常组织中的T细胞进行了单细胞转录组测序，发现在肝脏肿瘤组织中，特定的T细胞亚群（如CD8+T细胞和调节性T细胞）被优先富集并且克隆扩增，另外鉴定出LAYN基因在活化的CD8+T细胞和调节性T细胞中表达上调，并抑制CD8+T细胞的功能。这组转录组数据为了解癌症的免疫状况提供了宝贵的见解和丰富的资源。在肝癌相关研究中，有大量报道表明，较高数量的循环肿瘤细胞（circulatingtumor cells，CTC）与不良的临床结果之间存在直接的相关性[38]，但对于CTC完整分子特征的研究却很少。因此，D'Avola等[39]使用高密度单细胞转录组测序来表征肝癌患者中的CTC，证明了循环肿瘤细胞的异质性，这有助于检测HCC中已知的致癌驱动程序，并为使用液体活检开发肝癌生物标志物提供了全新的工具。针对肿瘤内高度异质性这一现状，Ho等[40]使用单细胞转录组测序分析肿瘤内细胞异质性以检测具有重要意义的稀有细胞亚群，发现根据EPCAM基因的表达高低可分出2个不同的主要细胞群，即CD24+和CD44+的细胞，表明肝细胞癌组织中可能存在与肿瘤增殖相关的新型细胞亚群。

随着单细胞测序技术的不断改善，单细胞基因组、DNA甲基化组和转录组测序方法都日渐成熟，但是，要同时准确分析单个哺乳动物细胞的基因组拷贝数变异，DNA甲基化组、转录组及其之间相互调节的机制，这些组学方法需要在同一细胞中进行。因此，Hou等[41]使用单细胞三重基因组测序技术（single-cell triple omics sequencing，scTrio-seq）研究人类肝细胞癌组织样品中的癌细胞，发现其中有2个亚群，其DNA拷贝数、DNA甲基化和RNA表达水平均不同。同时发现大规模的基因组拷贝数变异会导致获得或丢失的基因组区域内基因的RNA表达成比例变化，而这些基因组拷贝数变异通常不会影响这些区域的DNA甲基化。这为剖析基因组和表观基因组异质性对细胞群中转录组异质性的影响提供了新方向。

6 结语

在过去的几年里，单细胞捕获技术取得了显著进步，诸如微移液、梯度稀释、显微操作、流动辅助细胞分选等新方法在不断引入和改善，其中微流控平台被广泛应用于分离单个细胞，取得了巨大的成功[42]，但在组织解离过程中对单细胞转录组信息的影响还不得而知。另外，避免酶蛋白水解并最小化解离过程导致的基因表达变化，可能对我们分析细胞转录组，特别是解离敏感细胞的转录组，具有明显的帮助。

单细胞测序技术已成为一种在细胞水平上解构复杂组织的强大工具。在这项技术出现之前，几乎没有对肝脏组织以单细胞分辨率进行的研究，这极大地限制了对肝脏正常生理功能和疾病状态的分子水平的理解。目前可用的各种单细胞测序技术中，单细胞转录组测序是最成熟，也是应用最频繁和最广泛的方法。它利用更先进的技术检测单个细胞中详细的转录组信息，其研究方向包括恶性肿瘤、免疫反应和基质细胞亚群，以及促进侵袭和转移的细胞间相互作用等。

应用这项技术对正常和疾病状态下肝脏结构的单细胞水平解析以及肝脏相关疾病的发展恶化机制研究也在不断层层深入，如在鉴定新细胞亚群、解析细胞间高度异质性、探索细胞发育轨迹、发现全新炎症和肿瘤标志物、认识肿瘤免疫微环境、定位疾病发展恶化的关键细胞类型等方面，都有了许多新的发现。但同时，有几个关键问题制约了这项技术在肝脏研究中的应用。首先，就是难以获取新鲜肝脏组织；其次，肝脏组织中的一些易受剪切力、离心力等刺激的细胞类型（如肝实质细胞、肝窦内皮细胞等）在单细胞悬液制备过程中极易发生应激反应，这对最终细胞基因表达是否有影响还不得而知；另外，还可能致使有些细胞类型全部死亡，这会掩盖对这一细胞类型的探索，一定程度上破坏了组织结构解析的完整性。

单细胞测序领域正在迅速发展，基础化学和平台技术不断取得的新进展使人们能够以前所未有的分辨率研究单个细胞。未来这一技术无疑将在精准医学领域发挥越来越重要的作用，并将为了解组织发育、肿瘤内异质性、治疗耐药性的发展、肿瘤转移和演变的遗传驱动因素提供机会。随着新技术允许每个实验捕获更多数量的细胞，以及多种实验方法的结合，一次提取出的细胞信息也会越来越多，这种趋势可能会持续下去。可以预见的是，大规模、高通量将是下一步单细胞测序技术的发展方向。与此同时，其成本的下降和应用领域的拓展，会使该技术得到更广泛的应用，甚至有可能在将来的某一天彻底改变我们对疾病研究的方式。