肺炎支原体及其人用疫苗研究进展

梁宇 综述，廖国阳 审校

中国医学科学院北京协和医学院 医学生物学研究所，云南 昆明 650031

支原体是自然界存在的最小原核微生物，无细胞壁，高度多形性，能通过除菌滤器，可用无生命培养基培养增殖。对人致病的支原体主要有肺炎支原体、解脲脲原体、人型支原体等。肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，Mp）于1944年被Eaton等从一位原发性非典型性肺炎患者的痰标本中首次发现并分离[1]。在老年人慢性阻塞性肺炎（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）急性发作期患者中，Mp有较高的感染率，血清检测Mp阳性作为COPD的独立危险因素，阻碍了老年人长寿[2]。Mp是儿童常见的社区获得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）的主要病原体，20%～30%的CAP是由Mp感染所致[3]。多项研究观察到Mp流行的周期性趋势，每3～5年出现一次高峰，某些Mp感染并发症（如脑炎）会导致严重后果，尤其是在老年人、5岁以下儿童和免疫功能低下的患者中[4-5]。可见，Mp是影响人类健康最重要的病原体之一。

1 Mp及其发病机制

Mp基因组为环状双链DNA，仅816 kb，主要通过典型的二分裂方式繁殖，并倾向于在固体培养基中形成“油煎蛋”样菌落[6]。Mp的发病机制很复杂，主要包括黏附、细胞毒效应、免疫功能紊乱等。

1.1 细胞黏附

Mp引起细胞损伤的第一步是通过极化的黏附细胞器黏附至上皮细胞表面，抵抗粘液纤毛的清除和吞噬细胞的吞噬作用。黏附细胞器为一个顶端结构，由黏附蛋白、辅助蛋白及分子伴侣蛋白组成。黏附蛋白主要有P1、P30蛋白等，辅助蛋白包括高分子量（HMW）蛋白、P40和P90蛋白等，分子伴侣蛋白有Lon、TopJ蛋白等。黏附细胞器与肺纤毛上皮细胞的黏附过程是Mp感染的主要致病机制[7]。

实验证明P1和P30是直接参与受体结合的主要蛋白质，缺乏黏附蛋白P1的Mp突变株不能黏附在动物细胞上从而无致病性，而P30缺失或羧基端的酶促裂解可使Mp黏附功能完全丧失，滑动能力降低，形态和结构发生明显变化[8-9]。另外，P30黏附因子相关蛋白 A、B、C，HMW-1、HMW-2、HMW-3等充当辅助蛋白，可与P1和P30相互作用并协助细胞黏附，这些成分共同构成了特征性的“黏附蛋白复合物”[10]。该复合物通过形成细胞骨架维持Mp顶端结构的稳定，并将P1蛋白锚定在其细胞骨架中进行黏附。Mp与呼吸道上皮细胞表面的神经氨酸受体结合后，破坏了呼吸道黏膜表面的完整性，抑制了纤毛运动，消耗上皮细胞周围的营养物质，影响细胞代谢。此外，P1、P30、P90蛋白在维持Mp黏附细胞器的滑行运动方面也起着重要作用，这可能有助于细胞之间的转移[11]。最近研究显示，黏附细胞器的远端存在另外2种蛋白质，即P65和P116，它们可能通过与P1和P30黏附素相互作用帮助附着[12-13]。总之，Mp与宿主细胞的吸附能力取决于黏附蛋白复合物的位置以及各组分之间的相互作用。

1.2 细胞毒效应

研究表明，Mp可以侵袭和破坏细胞（如A549肺癌细胞），其侵袭能力取决于感染的持续时间和温度[14]。Mp感染人HepG2细胞和大鼠N2A细胞后，在激光共聚焦显微镜下可观察到细胞内有Mp，证实了Mp的细胞内侵袭破坏能力[15]。Mp侵入细胞有助于其逃避宿主的免疫清除和药物作用。此外，在侵袭过程中，Mp合成的某些酶和过氧化氢、超氧化物自由基等有毒物质可引起上皮细胞的氧化应激损伤[16]。Mp膜脂蛋白暴露于细胞外，通过TLR-1/2或TLR-1/2/6信号通路激活NF-κB，产生趋化因子和细胞因子，促进肺部淋巴细胞募集、中性粒细胞浸润及炎症反应[17]。

在Mp发现后几十年的研究里，人们一直没有找到与Mp致病直接相关的毒素，直到2005年才发现一种具有单腺苷二磷酸核糖基转移酶（mART）和空泡化活性的MPN372蛋白，即社区获得性呼吸窘迫综合征毒素（community acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX），其相对分子质量（Mr）为68 000，由591个氨基酸残基组成。Mp可以利用CARDS TX与表面活性蛋白A（SP-A）高亲和力结合，穿过宿主屏障并永久黏附于包含SP-A受体的靶细胞（如肺泡巨噬细胞、肺泡上皮Ⅱ型细胞以及肺内外的其他组织细胞）[18]。研究表明，重组CARDS TX作用于哺乳动物细胞，可产生不同形式的ADP-核糖基化蛋白和异常空泡化表型，破坏了单层细胞的完整性，从而导致细胞死亡[19]。有文献报道[20-21]，重组CARDS TX可诱导小鼠产生过敏性炎症反应和呼吸道高敏性，还可以剂量依赖性引起小鼠炎症和空泡形成的呼吸道组织病理学变化[22]。狒狒气管暴露于纯化的CARDS TX进行培养，能剂量依赖性地减缓并最终停止纤毛运动，破坏呼吸道细胞的完整性[23]。这些研究揭示CARDS TX涵盖了所有与Mp感染相关的呼吸道病变。

1.3 免疫功能紊乱

研究表明，Mp感染过程涉及各种特异性和非特异性免疫球蛋白及补体成分，如补体成分C1、C2、C3和C4水平的提高，B细胞数量的增加；在支原体肺炎的急性期和恢复期，血清中IgG、IgM、IgA和免疫复合物的含量显著增加，其中特异性sIgA可以防止呼吸道黏膜感染。另有研究表明，Mp感染可导致血清中总IgE水平升高，引起IgE介导的气道炎症和气道高反应性，从而诱发哮喘[24]。

在Mp感染患者中，CD4+T细胞减少，CD8+T细胞显著增加，这些变化在重症感染患者中更为明显。有报道称，在Mp感染期间，辅助性T淋巴细胞Th1/Th2比例不平衡，以Th1为主的大鼠表现出支气管周淋巴细胞聚集，而以Th2为主的大鼠表现出肺泡间充质细胞增生，这表明辅助性T淋巴细胞亚群的失衡与肺部损伤类型相关[25]。

在Mp感染的BALB/c鼠中，肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、IL-6、IL-8和IL-10的mRNA表达在肺部明显增加，而IL-2及其受体却没有增加[26]。IL-1β广泛参与了几种类型的损伤，包括组织破坏和水肿形成。IL-8参与白血细胞定位至炎症部位和浸润。TNF-α的血清水平与Mp感染疾病的严重性呈正相关[27]。此外，Mp抗原在体内和体外可诱导有效的免疫反应并增强Th17细胞应答，其中调节性T细胞（Treg）和IL-10与抑制IL-17A的产生有关[28]。Mp的细胞黏附分子还可通过TLR4和自噬诱导炎症反应[29]。

为了逃避宿主免疫系统的攻击，Mp易诱发表面膜抗原的变异。Mp上的甘油磷脂细胞膜与宿主细胞共享某些抗原成分，因此也可以逃避宿主的免疫监视，Mp的各种免疫逃逸机制使其可以在宿主体内长期存活。Mp膜抗原有红细胞（RBC）膜Ⅰ抗原的类似物，Mp对RBC的吸附可改变RBC膜的抗原性并诱导产生针对RBC膜Ⅰ抗原的自身抗体，即RBC的冷凝集素，从而诱导自身免疫性溶血性贫血[30]。此外，Mp的膜糖脂与人脑和肺组织存在部分共同抗原，Mp黏附蛋白P1和P30的羧基端与真核生物中的细胞骨架蛋白、纤维蛋白原、角蛋白和肌钙蛋白高度同源[31]。因此，Mp感染期间会在人体的脑、肺、淋巴细胞和心肌细胞中出现自身抗体，这些抗体形成免疫复合物并放大自身免疫反应，从而导致多系统免疫损伤。另有实验表明，Mp感染会严重破坏B细胞和T细胞，感染Mp 13～18周的患者血清IgG水平下降[32]。这些变化表明Mp感染可引起机体免疫抑制。

对Mp致病机制的研究不仅有助于Mp感染的防治，对Mp疫苗的开发也具有重要意义。

2 人用Mp疫苗研究现状

目前，兽用Mp减毒活疫苗和灭活疫苗在国内外都已上市，长期使用证明是安全有效的。然而，人用的针对性较强的Mp疫苗仍处于研发阶段。研究人员根据Mp致病机制，对其进行了大量的免疫原性研究，关注焦点主要集中在Mp的全菌体抗原、黏附蛋白抗原及CARDS TX，为Mp人用疫苗的最终创制奠定了基础。

2.1 全菌体抗原

由于担心Mp减毒株仍然残留毒性，因此减毒活疫苗从未进入临床试验阶段来进行有效性评估。20世纪六、七十年代进行了数个Mp灭活疫苗的人体临床试验，对其有效性和安全性的荟萃分析表明灭活Mp疫苗可将肺炎和上呼吸道感染的发生率降低仅约40%[33]。其保护效果弱的原因，可能是灭活剂改变了表面抗原的三维构象，影响疫苗的免疫原性。而应用灭活疫苗免疫后的志愿者再次面对野生型Mp感染时，出现了免疫激化反应，这种不良反应的发生使得Mp灭活疫苗的研发变得更加复杂。

2.2 主要黏附蛋白抗原

Mp要实现细胞黏附，需要黏附细胞器上存在的几种Mp蛋白进行复杂的相互作用，其中主要包括黏附蛋白 P1（Mr为 170 000）、P30（Mr为30 000）和 P116（Mr为 116 000）等，其中尤以 P1、P30蛋白为研究最热门的疫苗候选抗原，这2个黏附蛋白的编码基因均处于高度保守区域。P1基因由4884 bp组成，包含21个编码色氨酸的UGA密码子，而UGA在大肠杆菌中为终止密码子，使得P1蛋白在大肠杆菌中的重组表达受限。Chourasia[34]等通过密码子优化将整个P1基因合成为4个不同的片段，包括N端（P1-Ⅰ）片段、2个中间片段P1-Ⅱ和P1-Ⅲ、C端（P1-Ⅳ）片段，将其克隆在大肠杆菌系统中表达，结果表明在Mp P1蛋白整个长度上的多个位置都存在免疫优势区域，而该蛋白的N端和C端区域是表面暴露的，针对这2个区域的抗体能显著阻止黏附，这些结果对Mp疫苗研发具有重要意义。

P30黏附蛋白在维持Mp黏附细胞器的细胞结构和滑行运动方面也起着重要作用。P30基因由825 bp组成，第46～48位为UGA。P30蛋白是一种膜结合蛋白，由275个氨基酸残基构成，N端位于胞内而C端暴露在细胞表面，可分为4个结构域，即前导肽区（SP）、胞内段（结构域Ⅰ）、跨膜区（TM）及胞外区（包括结构域Ⅱ和Ⅲ）。其中，结构域Ⅲ有3个富含脯氨酸的重复区，这些重复结构与己被证实有免疫原性的Mp P1蛋白C端结构的同源性大于40%[35]。P30蛋白中部分氨基酸序列与人体某些器官组织蛋白的相似度很高，存在交叉免疫原性，可能是引起Mp感染后肺外并发症及自身免疫反应的原因。Schurwanz等选取P1免疫原性最强的部分和P30融合表达蛋白，将蛋白免疫豚鼠后得到接近于Mp全菌体免疫豚鼠后血清的效果[36]。

此外，P116蛋白中的某些片段与P1-C蛋白也非常相似，亦表现出免疫原性。抗P116抗体可阻止Mp黏附于Hep-2细胞，表明P116蛋白可能是独立于P1的重要黏附蛋白[37]。

2.3 CARDS TX蛋白

CARDS TX是由Mp产生的具有ADP-核糖基转移酶和细胞空泡化活性的外毒素，由MPN372基因编码。X线晶体结构显示，该毒素由17个α螺旋和43条β链组成，它们折叠成3个区域（D1、D2、D3），呈等腰三角形。D1区 N 端有ADP-核糖基化转移酶活性，序列与百日咳毒素S1亚单位有27%相同。D2+D3区在C端形成一个串联的β-三叶草结构，与蓖麻毒素B的折叠和相对方位相似，但不具有半乳糖结合位点[38]。D3区介导CARDS TX结合、进入宿主细胞，D2+D3具有介导细胞空泡化的活性[39]。Mp感染产生针对CARDS TX的高效价抗体，表明CARDS TX具有较强的免疫原性，可作为候选疫苗组分。

此外，随着肺炎球菌和脑膜炎球菌多糖疫苗的研制成功，将特异性的多糖纯化后制备Mp多糖疫苗，可以为研究者提供新思路。

3 结语

近年来，随着抗生素类药物的广泛应用，出现耐大环内酯抗生素肺炎支原体（macrolide-resistantM.pneumoniae，MRMP）的流行，且尚无详细的关于MRMP的治疗方案，给Mp感染的控制和治疗带来更大的挑战[40]。因此，MRMP的出现进一步促使疫苗成为防控Mp感染的重要策略。

随着肺炎链球菌疫苗的上市和使用，未来Mp可能成为最普遍的非病毒性呼吸道病原体。因此，研制出有效的人用Mp疫苗，不仅可以防止重症感染的严重后果，而且可以减少对轻症患者生产生活带来的影响，在高风险人群如儿童、老年人和医护人员中尤其重要。