GLYX-13通过NR2B-ERK-CREB信号通路改善氯胺酮麻醉后幼鼠认知功能障碍①

郑文婧 郄晓娟 郑文芳

(衡水市人民医院麻醉科，衡水 053000)

认知功能障碍是手术患者麻醉后常见的中枢神经系统并发症，氯胺酮在抗焦虑、抗抑郁、小儿麻醉等方面有广泛的应用，研究发现氯胺酮呈时间依赖性和剂量依赖性促进幼鼠神经元变性、坏死和凋亡，可引起幼鼠认知功能损害[1，2]。因此探讨预防和治疗由氯胺酮麻醉所致的认知功能障碍在临床上具有重要意义。GLYX-13为苏氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苏氨酸多肽，可与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体甘氨酸位点结合，增强小鼠的学习记忆能力[3，4]，但其作用机制尚不清楚。NR2B-ERK-CREB信号通路与大鼠的学习、记忆的形成关系密切[5，6]。本文对GLYX-13对氯胺酮麻醉后幼鼠认知功能障碍及海马组织NR2B-ERK-CREB信号通路的影响进行研究，探讨GLYX-13改善氯胺酮麻醉后幼鼠认知功能障碍的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康、清洁级、雌雄各半、3周龄、体质量7～10 g、C57BL/6小鼠60只[北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2014-000]。

1.1.2主要试剂 盐酸氯胺酮注射液(福建古田药业有限公司，批号：H35020148)，GLYX-13(美国Sigma公司，批号：015M4731V)，Morris水迷宫、旷场实验(美国Noldus公司)，BCA法蛋白定量试剂盒、ECL发光液(美国Proteinech Group公司)，兔抗鼠NR2B多克隆抗体、兔抗鼠ERK多克隆抗体、兔抗鼠p-ERK多克隆抗体、兔抗鼠CREB多克隆抗体、兔抗鼠p-CREB多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体、罗丹明荧光标记山羊抗兔二抗(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组及处理 将60只幼鼠根据随机数字法分为对照组(NS组)、氯胺酮麻醉组(Ket组)、氯胺酮麻醉+GLYX-13组(Ket+GLYX-13组)，每组20只。Ket组和Ket+GLYX-13组小鼠每天腹腔注射30 mg/kg氯胺酮，间隔30 min重复一次，每天3次，共5 d[7]；Ket+GLYX-13组小鼠每天首次注射氯胺酮前2 h尾静脉注射1 mg/kg GLYX-13(参照文献[4，8]选择GLYX-13剂量为1 mg/kg)共5 d；NS组小鼠每天注射等量生理盐水，共5 d。

1.2.2水迷宫实验 将一高60 cm、直径120 cm圆形水池中注入清水，水温维持在22～26℃，将水池分为4个象限，将平台放置在第一个象限内，平台顶位于水下1.5 cm。前4 d每天上午10点进行定位航行试验：将小鼠按照1至4象限的顺序放入水池中，记录小鼠逃避潜伏期，即1 min内找到平台所需要的时间，若小鼠在1 min内无法找到平台则引导小鼠上平台，将其逃避潜伏期记录为1 min，取4个象限平均值。第5天上午10点进行空间探索实验：将平台从水池中撤除，将小鼠从第3象限放入水池，记录小鼠在1 min内穿越原平台象限次数和在原平台象限停留时间。

1.2.3旷场实验 每天下午4点进行旷场实验，正方形的旷场箱底部划分为25个大小相等的方格，中间的9个方格为旷场中心区，将小鼠放置在旷场箱中央区自由活动，记录15 min内小鼠在中心区停留时间，共测试3 d。

1.2.4Western blot法测定海马组织NR2B、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB蛋白水平 小鼠行为学实验结束后，每组取10只小鼠，戊巴比妥钠腹腔麻醉后，断头取海马组织，取100 mg海马组织加入Lysis Buffer裂解液裂解海马组织，提取海马组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，经电泳、转膜、封闭后，加入一抗：兔抗鼠NR2B多克隆抗体(1∶2 000)、兔抗鼠ERK多克隆抗体(1∶500)、兔抗鼠p-ERK多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗鼠CREB多克隆抗体(1∶5 00)、兔抗鼠p-CREB多克隆抗体(1∶1 000)过夜孵育，以β-actin为内参照，加入二抗(1∶3 000)孵育2 h，加入ECL发光液显影，采用Quantity One 4.6.2图像分析系统分析条带灰度值，目标蛋白水平以目标蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。

1.2.5采用免疫荧光法测定海马CA1区NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白表达情况 取各组小鼠行为学实验结束后每组剩余的10只小鼠，麻醉后断头处死，取小鼠海马组织在福尔马林中过夜固定，取出海马组织块经梯度脱水、透明、浸蜡、包埋，切成5 μm厚切片。将石蜡切片烤片30 min，脱蜡、脱水，加入柠檬酸盐缓冲液煮沸12 min修复抗原，加入Tritonx-100通透30 min，加入山羊血清封闭40 min，加入一抗过夜孵育，加入罗丹明荧光标记二抗孵育1 h，加入DAPI封片，镜下观察荧光染色情况，采用Image-Pro plus图像分析软件分析阳性荧光信号强度，二抗标记的免疫阳性细胞呈红色。阳性对照标本：一抗(NR2B、p-ERK、p-CREB)滴加海马组织切片，之后加罗丹明荧光标记二抗；阴性对照标本：PBS代替一抗滴加组织切片。

2 结果

2.1三组小鼠水迷宫实验结果比较 与NS组比较，Ket组和Ket+GLYX-13组小鼠逃避潜伏期延长(P<0.05)，穿越原平台象限次数和在原平台象限停留时间降低(P<0.05)；与Ket组比较，Ket+GLYX-13组小鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05)，穿越原平台象限次数和在原平台象限停留时间升高(P<0.05)，见表1。

2.2三组小鼠旷场实验中心区停留时间比较 与NS组比较，Ket组和Ket+GLYX-13组小鼠3 d中心区停留时间均缩短(P<0.05)；与Ket组比较，Ket+GLYX-13组小鼠3 d中心区停留时间均延长(P<0.05)，见表2。

2.3三组小鼠海马组织NR2B、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB蛋白水平比较 三组小鼠海马组织ERK、CREB蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；三组小鼠海马组织NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平比较差异有统计学意义(P<0.05)：与NS组比较，Ket组和Ket+GLYX-13组小鼠海马组织NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平降低(P<0.05)；与Ket组比较，Ket+GLYX-13组小鼠海马组织NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平升高(P<0.05)，见表3和图1。

2.4三组小鼠海马CA1区NR2B、 p-ERK、 p-CREB荧光阳性信号强度比较 与NS组比较，Ket组和Ket+GLYX-13组小鼠海马CA1区NR2B、p-ERK、p-CREB荧光阳性信号强度降低(P<0.05)；与Ket组比较，Ket+GLYX-13组小鼠海马CA1区NR2B、p-ERK、p-CREB荧光阳性信号强度升高(P<0.05)，见表4和图2。

GroupsnEscape latency(s)Day 1Day 2Day 3Day 4Number of quadrants crossingthe original platform(times)In the original platformquadrant residence time(s)NS group2055.24±6.1342.13±4.7622.14±2.9816.47±1.898.69±1.2417.68±2.13Ket group2068.25±6.371)53.24±5.171)33.27±3.121)23.16±2.141)3.15±1.031)9.24±1.171)Ket+GLYX-13 group2060.14±5.821)2)48.71±5.691)2)27.39±2.911)2)19.32±1.781)2)6.26±1.211)2)14.35±1.091)2)F23.12322.90268.68359.738113.889152.856P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

GroupsnResidence time in the central area(s)Day 1Day 2Day 3NS group2057.32±5.3656.47±5.2557.86±4.79Ket group2025.15±4.981)26.71±4.871)26.34±4.851)Ket+GLYX-13 group2049.72±5.131)2)48.58±5.221)2)49.12±5.211)2)F212.451181.618215.842P<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

GroupsnNR2BERKp-ERKCREBp-CREBNS group100.37±0.080.72±0.130.39±0.070.84±0.150.64±0.13Ket group100.09±0.041)0.69±0.120.11±0.031)0.83±0.140.18±0.071)Ket+GLYX-13 group100.18±0.051)2)0.71±0.140.21±0.061)2)0.85±0.130.43±0.101)2)F58.3810.13864.2550.05150.031P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

GroupsnNR2B fluorescencepositive signal intensityp-ERK fluorescencepositive signal intensityp-CREB fluorescencepositive signal intensityNS group100.042±0.0090.034±0.0080.051±0.007Ket group100.016±0.0071)0.013±0.0051)0.010±0.0051)Ket+GLYX-13 group100.027±0.0081)2)0.022±0.0071)2)0.024±0.0091)2)F26.34024.13084.065P<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

图1 三组小鼠海马组织NR2B、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB蛋白Western blot电泳图Fig.1 Western blot analysis of NR2B,ERK,p-ERK,CREB and p-CREB proteins in hippocampus of three groups of miceNote:A.NS group；B.Ket group；C.Ket+GLYX-13.

图2 免疫荧光法测定三组小鼠海马CA1区NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白表达(×200)Fig.2 Immunofluorescence assay for NR2B,p-ERK,and p-CREB protein expression in hippocampal CA1 region of three groups of mice(×200)

3 讨论

氯胺酮镇痛效果好，无明显呼吸抑制作用，在小儿全身麻醉和基础麻醉中应用广泛[9]。但近来研究发现氯胺酮可对大脑产生损伤，导致认知功能障碍[10]。氯胺酮可通过诱导神经元细胞凋亡等方式对脑组织造成损害，影响近期和远期认知功能障碍[11,12]。因此在麻醉过程中联合其他药物或其他脑保护手段可减轻氯胺酮对神经元的毒性作用，减轻脑组织损伤，减少氯胺酮对认知功能的损伤，提高麻醉安全性。

兴奋性氨基酸(谷氨酸)在哺乳动物中枢神经系统中广泛存在，是一种生理兴奋性递质，对突触功能及可塑性具有重要作用，NMDA受体由多个受体亚单位组成的一种异五聚体，对钙离子有高通透性[13，14]。在正常情况下，钙离子通道被镁离子电压阻断，当大量谷氨酸和NMDA受体亚基NR2B高亲和性结合时，可以置换出离子通道中的镁离子，激活NMDA受体对钙离子的高通透性，从而产生兴奋毒性[15]。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)亚家族成员，当上游的ERK激酶受到突触内NMDA受体钙离子通道钙内流的刺激时，ERK可发生磷酸化，磷酸化的ERK(p-ERK)核转位，并磷酸化下游的CREB，CREB为促存活转录因子，磷酸化的CREB(p-CREB)可通过调节脑源性神经营养因子等基因的表达，减少神经元的凋亡[16,17]。海马组织缺乏NR2B可引起学习记忆等认知功能障碍，高表达NR2B可通过ERK信号通路参与海马学习记忆的巩固，ERK可激活CREB，磷酸化的CREB参与海马记忆的形成，从而提高认知功能[18,19]。

NMDA受体是麻醉药物作用的关键部位，麻醉药物和NMDA受体结合可拮抗NMDA受体的作用，引起神经元变性坏死，抑制神经营养谷氨酸供给大脑，影响大脑功能。GLYX-13可作用于含NR2B的NMDA受体甘氨酸位点，提高NR2B亚基蛋白的表达水平，增强海马的学习记忆能力。GLYX-13可促进海马CA1区突触传递，可增加突触传递过程的长时程增强幅度，减少长时程抑制的发生[20,21]。

本研究发现：氯胺酮可延长小鼠逃避潜伏期，降低穿越原平台象限次数并在原平台象限停留时间和中心区停留时间均缩短，降低海马组织NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平且海马CA1区NR2B、p-ERK、p-CREB荧光阳性信号强度。表明氯胺酮可引起幼鼠认知功能障碍，其机制可能为氯胺酮和NMDA受体NR2B亚基结合，降低NR2B水平，NR2B表达水平降低抑制ERK磷酸化，从而抑制CREB磷酸化，损害海马组织的认知功能。氯胺酮麻醉幼鼠给予GLYX-13处理可缩短小鼠逃避潜伏期，延长穿越原平台象限次数、在原平台象限停留时间和中心区停留时间，提高海马组织NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平且海马CA1区NR2B、p-ERK、p-CREB荧光阳性信号强度升高。表明GLYX-13可能通过作用于含NR2B的NMDA受体甘氨酸位点，提高NR2B亚基蛋白的表达水平，通过激活ERK和CREB增加海马的认知能力。

综上所述，氯胺酮可引起幼鼠认知功能障碍，GLYX-13可能通过激活NR2B/ERK/CREB信号通路发挥中枢神经保护作用，改善氯胺酮引起的幼鼠认知功能障碍。