针刺对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的神经保护作用及对小胶质细胞和炎症反应的影响①

张英英 单海军 郭 鑫

(河南省中医院儿童脑病康复科,郑州 450002)

新生儿缺氧缺血性脑病是指新生儿围生期窒息引起的缺氧缺血性脑损伤，是新生儿不可逆性脑损伤和新生儿死亡的主要原因，轻者可引起患儿轻度瘫痪、学习障碍、注意力缺陷、细微运动问题等，严重者可遗留癫痫、脑性瘫痪等难治性儿童脑病，针刺在治疗缺氧缺血性脑病中取得较好效果[1,2]，但其机制尚不十分清楚。缺氧缺血性脑病的病理生理过程比较复杂，可出现脑水肿、自由基产生、神经递质释放、炎症反应、小胶质细胞活化等，小胶质细胞是中枢神经系统固有的免疫细胞，在缺氧缺血脑损伤刺激下小胶质细胞过度活化[3]，释放大量炎症细胞因子，特别是IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎性细胞因子，加重炎症反应，引起脑组织损伤[4,5]。本文就针刺对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的神经保护作用及对小胶质细胞及炎症反应的影响进行研究，探讨针刺治疗缺氧缺血性脑病的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 7日龄、清洁级、新生、体重12～14 g、SD大鼠150只[购自河南省动物实验中心，合格证号：SYXK(豫)2013-0024]。

1.1.2主要试剂 TTC(美国Sigma公司)，IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒(美国Abcam公司)，DAB显色试剂盒、免疫组化试剂盒、羊抗小鼠Iba-1抗体(美国Santa Cruz公司)等。

1.2方法

1.2.1分组及缺氧缺血性脑损伤模型建立 将150只大鼠根据随机数字法分为假手术组、模型组和针刺组，每组50只。模型组和针刺组大鼠采用RICE法建立缺氧缺血性脑损伤模型：乙醚吸入麻醉成功后，在大鼠中位颈部切口，分离左侧颈总动脉，并进行结扎，缝合伤口，2 h后，将大鼠置于密闭缺氧环境中，给予92%N2+8%O2混合气体缺氧处理2.5 h。假手术组大鼠不进行血管结扎及缺氧处理。

1.2.2各组大鼠处理 建模后，假手术组和模型组大鼠不进行针刺处理，针刺组大鼠进行针刺处理：选择“靳三针疗法”中的“脑三针”“颞三针”“智三针”取穴，结合人与动物的骨度比、参照《实验针灸学》进行穴位定位。脑三针：从大鼠颈椎向上摸到枕骨粗隆上缘向上0.1寸为第1针，向两旁摸到枕骨粗隆两侧缘定位第2针和第3针；颞三针：大鼠耳根上缘中点向上0.5寸为第1针，前后耳根向上与第1针水平处定位第2针和第3针；智三针：从两眼连线中点向上摸到额骨和顶骨之间的冠状缝定位第1针，眼睛内外眦连续外1/3向上0.3寸定位第2针和第3针。每个穴组先刺第1针，再刺第2针和第3针，“脑三针”和“颞三针”向下平刺，“智三针”向百会方向平刺，每个穴位得气后行捻转手法均匀、持续捻转20 s，120次/min，不留针，每天1次，共7 d。

1.2.3取材 治疗结束后，各组随机取10只大鼠断头处死，取脑组织置于PBS液中冷却，用于脑组织TTC染色；各组取10只大鼠，灌注固定后取脑组织，梯度脱水、透明、石蜡包埋，用于脑组织小胶质细胞标记物Iba-1表达测定；各组取10只大鼠，取大鼠脑组织放入液氮中保存，用于ELISA和RT-PCR检测；各组取10只大鼠用于空间学习记忆能力测定。各组剩余大鼠用于其他实验研究。

1.2.4脑梗死情况测定 将PBS液中脑组织沿冠状面切片，厚度2 mm，5片。采用TTC染色法对脑组织进行染色，将脑组织切片浸入TTC溶液中孵育30 min，PBS液冲洗，福尔马林溶液中固定，染色固定后梗死区域脑组织呈白色，正常脑组织呈红色，采用Image J 1.8.0软件测量脑梗死面积，计算脑梗死面积占同侧脑组织总面积百分比。

1.2.5脑组织小胶质细胞标记物Iba-1表达测定 采用免疫组化法测定脑组织小胶质细胞标记物Iba-1表达情况：脑组织石蜡包块切成厚5 μm切片，室温复温15 min，烘烤30 min，脱蜡至水，滴加山羊血清孵育20 min，加入Iba-1抗体过夜孵育，滴加聚合物辅助剂孵育20 min，滴加二抗孵育20 min，DAB显色，染核、脱水、封片后，采用Image Pro Plus 6.0图像分析系统对图像进行分析，每张切片选5个400倍高倍视野计算平均阳性细胞数。

1.2.6脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平测定 每只大鼠取50 mg脑组织，加入Trizol孵育5 min，提取总RNA，采用实时荧光定量Real-time PCR 检测测定脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平，以β-actin为内参照，反应条件：95℃ 3 min；94℃ 15 s、62℃ 40 s，共40个循环。IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相对表达量以IL-6、IL-1β、TNF-α表达量与β-actin表达量的比值表示。

1.2.7脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α水平测定 每只大鼠取50 g脑组织加入匀浆液匀浆后，离心(12 500 r/min)25 min，取上清液，采用ELISA法测定脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α水平(具体步骤严格按照试剂盒说明书进行)。

1.2.8大鼠空间学习记忆能力测定 治疗结束后14 d(大鼠28 d龄)时，每组取10只大鼠，采用Morris水迷宫测定大鼠空间学习记忆能力。第1天至第5天对大鼠进行平台训练，将直降14 cm、高32 cm平台置于迷宫中水下1 cm处，从4个不同方向随机分4次放入迷宫中，自由探索直到找到平台，其到达平台的时间为逃避潜伏期，2 min内没有找到平台者被引导至平台并停留15 s，记录逃避潜伏期为2 min，记录各组大鼠第5天的逃避潜伏期进行比较。第6d进行空间搜索，从迷宫中将平台移除，从平台相对应的位置将大鼠放入迷宫，测试2 min，观察大鼠穿过平台位置的次数，将其作为大鼠穿台指数。

2 结果

2.1各组大鼠空间学习记忆能力比较 与假手术组比较，模型组和针刺组大鼠逃避潜伏期延长(P<0.05)，穿台指数降低(P<0.05)；与模型组比较，针刺组大鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05)，穿台指数增加(P<0.05)。见表1。

2.2各组大鼠脑梗死面积比较 假手术组大鼠脑组织均呈红色，无梗死现象；模型组大鼠脑组织出现大片明显的白色梗死区域；针刺组大鼠脑组织出现小部分白色梗死区域。针刺组脑梗死面积明显低于模型组(P<0.05)。见图1和表2。

2.3各组大鼠脑组织Iba-1表达情况 与假手术组比较，模型组和针刺组大鼠脑组织Iba-1阳性细胞增多(P<0.05)，与模型组比较，针刺组大鼠脑组织Iba-1阳性细胞减少(P<0.05)。假手术组大鼠脑组织区见少量小胶质细胞，小胶质细胞胞体瘦长，有细长的分枝状突起，处于未活化状态；模型组大鼠脑组织区见小胶质细胞增多，胞体变大，突起粗大，呈活化状态；针刺组大鼠脑组织区小胶质细胞明显少于模型组。见表2和图2。

表1 各组大鼠空间学习记忆能力比较

Tab.1 Comparison of spatial learning and memory ability of rats in each group

GroupsnEscape latency (s)Wearing indexSham operation group108.67±1.965.46±1.43Model group1018.24±4.951)2.04±0.651)Acupuncture group1012.47±2.831)2)3.52±0.871)2)F19.16227.371P<0.001<0.001

Note：Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

2.4各组大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平比较 与假手术组比较，模型组和针刺组大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相对表达量升高(P<0.05)；与模型组比较，针刺组大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相对表达量降低(P<0.05)。见图3。

2.5各组大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组和针刺组大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)；与模型组比较，针刺组大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)。见表3。

图1 各组大鼠脑组织TTC染色图Fig.1 TTC staining of brain tissue of rats in each group

表2 各组大鼠脑梗死面积和脑组织Iba-1阳性细胞比较

Tab.2 Comparison of cerebral infarct size and brain tissue Iba-1 positive cells in each group

GroupsnCerebralinfarct size(%)Brain tissue Iba-1positive cellsSham operation group10-7.45±1.41Model group1042.15±4.481)27.38±4.721)Acupuncture group1031.23±3.141)2)16.57±3.091)2)F6.31288.310P<0.001<0.001

Note：Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

图2 各组小鼠脑组织小胶质细胞活化免疫组化染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of microglia in brain tissue of each group (×400)

表3 各组大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平比较

Tab.3 Comparison of IL-6,IL-1β and TNF-α levels in brain tissue of rats in each group

GroupsnIL-6(pg/mg)IL-1β(pg/mg)TNF-α(pg/mg)Sham operation group1053.26±12.6316.46±12.3747.35±11.42Model group10175.35±34.211)42.34±16.531)98.26±17.531)Acupuncture group1096.24±18.561)2)27.48±14.211)2)62.14±13.471)2)F68.7208.05533.232P<0.0010.002<0.001

Note：Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

图3 各组大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相对表达量Fig.3 Relative expression of IL-6,IL-1β and TNF-α mRNA in brain tissue of rats in each group

3 讨论

新生儿缺氧缺血后可引起酸中毒、低血糖、氧自由基损伤、细胞内钙超载、小胶质细胞活化、兴奋毒作用、细胞因子释放等变化，上述因素的变化及相互作用共同引起脑损伤。小胶质细胞来源于胚胎前期骨髓干细胞，成熟后广泛分布在中枢神经系统，正常状态下，小胶质细胞处于休眠或静息状态，活性低，无抗原提呈功能，无吞噬功能，从而使脑内免疫处于比较低的水平；在脑组织受到损伤等刺激后，小胶质细胞可迅速活化，发生功能、形态、免疫显型变化，引起免疫应答反应，释放大量炎性介质和细胞毒素，分泌炎性细胞因子[6,7]。活化的小胶质细胞和促炎因子是神经炎症的特征性表现，小胶质细胞是神经炎症的主要效应细胞，在脑组织受到缺氧缺血性损失时，小胶质细胞最先被活化，活化的小胶质细胞胞体变肥大，突起缩短，数量增加[8]，活化的小胶质细胞对神经系统具有两种作用：一方面可通过释放大量神经营养因子、抗炎细胞因子、血管内皮生长因子等吞噬损伤神经细胞、促进血管生成、抑制炎症反应，减轻神经元损伤，发挥神经保护作用；另一方面可释放IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性细胞因子、氧自由基、一氧化氮等启动炎症反应，引起神经元损伤[9,10]。可见，小胶质细胞具有保护神经元和引起神经元损伤的双重作用，但过度活化的小胶质细胞则是引起持续性炎症反应的主要原因，过度活化的小胶质细胞可引起IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子的大量释放，大量促炎细胞引起又可不断活化小胶质细胞，损伤神经元，形成恶性循环，导致神经损伤[11,12]。

针刺治疗缺氧缺血性脑损伤具有不可替代和特定的优势[13,14]，主要原理为针刺通过刺激人体经络调节气血运行和人体脏腑器官功能，针刺具有操作简单、无不良反应、疗效肯定的优势，有着极大的经济效益和社会效益[15,16]。靳三针疗法是一种传统针灸疗法，近年来在针灸治疗小儿脑病方面的研究取得了比较满意的效果[17]。本文采用“靳三针疗法”治疗缺氧缺血性脑损伤大鼠模型，发现针刺可显著降低缺氧缺血性脑损伤大鼠逃避潜伏期、增加穿台指数、减少脑梗死面积、降低脑组织Iba-1阳性细胞数量和脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α水平。可见，针刺对缺氧缺血性脑损伤大鼠具有脑保护作用，其机制可能为缺氧缺血引起脑组织小胶质细胞过度活化，过度活化的小胶质细胞释放IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性细胞因子，大量生成的IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性细胞因子又进一步活化小胶质细胞，形成恶性循环引起脑组织损伤；针刺通过降低缺氧缺血引起的脑小胶质细胞活化、降低IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性细胞因子水平，从而发挥对脑组织的保护作用。

综上所述，针刺可能通过降低小胶质细胞活化和炎症反应发挥对缺氧缺血性脑损伤的保护作用。