类风湿关节炎患者血清中IL-17表达及IL-17F基因位点rs763780多态性分析

邓燕群 刘翠玉 尹志华 张允奇 罗秀霞

(深圳市福田区风湿病专科医院检验科，深圳 518040)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是风湿性疾病中最为常见的一种疾病，至今病因未明，目前大部分研究机构认为，RA是由遗传和环境因素相互作用所致的，其中约50%的RA发病与遗传基因易感性有关[1，2]。RA是一种有遗传倾向的多基因疾病，具有复杂的遗传背景。国内外已有很多RA基因多态性分析研究报道，但仍未找到特异性基因，且不同地区、不同人群SNP的基因多态性分布因遗传背景和生活环境因素的不同而存在很大差异性[3，4]，同时还有研究表示，一些基因位点多态性与RA自身抗体、细胞因子及炎性物质的产生也存在一定相关性[5，6]。因此，探索RA相关易感基因多态性及自身抗体、细胞因子及炎性物质对RA发病机制的阐明、诊断、治疗及研发基因治疗靶点药物具有重要临床意义。为此，本文对深圳地区RA患者的IL-17F基因位点rs763780单核苷酸多态性及细胞因子、自身抗体和炎症性物质进行调查研究分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象 收集2016年1月～2018年10月来深圳市福田区风湿病专科医院就诊的RA患者176例，其中男81例，女95例，年龄31～52岁，平均(40.62±10.25)岁，均符合2009年美国风湿病协会修订的RA诊断标准[1]，且3个月内未接受免疫抑制剂及激素类药物治疗。并选取同期来院体检的健康人群110例，其中男48例，女62例，年龄(30～53)岁，平均(41.63±11.05)岁。排除标准：①合并其他自身免疫性疾病；②孕产妇及哺乳期的妇女；③心功能不全及肝肾功能障碍者；④合并糖尿病、高血压、急性感染及恶性肿瘤等疾病患者。确保两组的年龄和性别等一般性资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有患者均签署了自愿协议书，并经医院伦理委员会批准同意。

1.1.2仪器与试剂 全血DNA基因组提取试剂盒由深圳亚能生物技术有限公司提供；CFX-96 PCR仪由美国Bio-Rad公司提供；紫外可见凝胶成像系统、核酸分析仪由德国Eppendorf公司提供；HSP92II限制性内切酶由美国Fermentas公司提供；去核酸酶水、PreMix Taq DNA聚合酶由美国Promega公司提供；琼脂糖凝胶由西班牙Biowest公司提供；IL-17试剂盒由美国Rapidbio公司提供；DXC600全自动生化分析仪由美国Bankman公司提供。

1.2方法

1.2.1标本采集 所有研究对象采集静脉血5～6 ml，其中2 ml加入EDTA-K2抗凝管内混匀用于全血DNA提取用；剩余的血加入一次性无抗凝剂干燥管内，用于IL-17、RF及CRP检测用，均及时送检。

1.2.2IL-17、RF及CRP检测 IL-17含量采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测，RF和CRP采用免疫比浊法检测，所有操作均严格按照仪器和试剂盒说明书进行。

1.2.3DNA提取 全血DNA基因组提取采用深圳亚能生物技术有限公司提供的试剂盒进行提取，操作按试剂盒说明书进行，DNA提取完成后通过电泳检测其是否完整，并采用紫外分光光度仪检测其浓度以及纯度，合格后置于-70℃保存备用。

1.2.4IL-17F基因位点rs763780多态性分析 ①引物设计：引物利用Primer Premier 5软件设计，引物为F：5′-GGGAATGCAAACAAACACCTGAA-3′，R：5′-CCGTTCCCATCCAGCAAGAGA-3′;②PCR反应体系：总体积6.4 μl，其中DNA模版1 μl、10 μmol/L的上下游引物各0.2 μl、去核酸酶水2 μl、PreMix Taq DNA聚合酶3 μl；③PCR扩增条件为：95℃预变性5 min→95℃变性30 s→60℃30 s→72℃延伸30 s，反复循环36次→72℃延伸5 min；④电泳：于5 μl 的PCR扩增产物中加入2 μl限制性内切酶，37℃孵育6 h以上，于酶切后的PCR产物中加入3%的琼脂糖凝胶，经Goldview染色，置于250 V电压下进行电泳，然后利用Bio-Rad凝胶成像仪检测分型结果。

2 结果

2.1两组Hardy-Weinberg遗传平衡分析 经χ2检验，RA组和对照组IL-17F基因位点rs763780位点实际基因型分布与Hardy-Weinberg平衡状态下的理论分布差异无统计学意义(χ2=1.290 3，P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，达到遗传平衡，具有群体代表性。

2.2两组血清中IL-17、RF及CRP含量比较 RA组血清中IL-17、RF及CRP含量分别为(36.73±11.06)pg/ml，(58.05±14.92)U/ml和(32.15±13.96)mg/L，明显高于对照组的(14.52±6.35)pg/ml，(10.24±5.32)U/ml和(6.81±3.25)mg/L，差异均有统计学意义(t=3.035 7～5.320 6，P<0.05)。

2.3两组IL-17F基因位点rs763780基因型及等位基因频率比较 RA组CC基因型和C等位基因检出率分别为19.32%和41.48%，明显高于对照组的6.36%和26.82%，差异有统计学意义(χ2=3.916 5～5.054 7，P<0.05)，结果见表1。

表2 RA组基因型血清中IL-17，RF及CRP含量比较

Tab.2 Comparison of IL-17,RF and CRP in genotype serum of RA group

ItemCC genotypeCT genotypeTT genotypetPIL-17(pg/ml)42.96±13.6430.25±10.7426.07±9.522.7163-3.5750<0.05RF(U/ml)57.02±13.0356.58±12.3959.85±15.760.6815-0.9371>0.05CRP(mg/L)35.19±14.3232.53±12.8729.74±11.300.8573-1.1203>0.05

表1 RA组与对照组IL-17F基因位点rs763780基因型及等位基因频率比较[n(%)]

Tab.1 Comparison of rs763780 genotype and allele frequency of IL-17F locus in RA group and control group[n(%)]

GroupsnGenotype frequencyCCCTTTAllele frequencyCTRA17634(19.32)78(44.32)64(36.36)146(41.48)206(58.52)Control1107( 6.36)45(40.91)58(52.73)59(26.82)161(73.18)

图1 IL-17F基因位点rs763780扩增产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis results of rs763780 amplification product of IL-17F gene locusNote:M.Marker;1 and 2.CT genotypes; 3,6 and 8 .TT genotypes; 4,5,and 7.CC genotypes.

2.4电泳结果 PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，IL-17F基因位点rs763780分别于407、290及117 bp处显色检出TT、CT及CC三种基因型，结果见图1。

2.5RA组基因型血清中IL-17、RF及CRP含量比较 RA组IL-17F基因位点rs763780 CC基因型中的IL-17水平为(42.96±13.64)pg/ml，明显高于其他基因型，差异有统计学意义(P<0.05)，而三种基因型血清中RF和CRP水平之间差异均无统计学意义(P>0.05)，结果见表2。

3 讨论

RA是一种以关节滑膜慢性炎症为主要特征的自身免疫性疾病，我国发病率约为0.24%～0.5%，女性多于男性，约为2～3∶1，主要表现为局部关节在早晨起床时不灵活、关节畸形、疼痛、肿胀、错位等，并伴有不同程度的疲乏、低热和体重减轻[7]，严重者病变还会累及全身各个器官，引起类风湿病，且RA为一种反复发作性疾病，致残率较高，严重影响患者的生存质量和身体健康，且预后不良，目前还没有很好的根治方法，早期诊断并积极诱导疾病缓解是防治并发症的关键[8]。因此，加强RA发病机制的研究对RA的早期诊断、治疗、预防及基因靶向治疗药物的研发具有重要的意义。

RA发病机制十分复杂，据有关文献结论显示，多种细胞因子、自身抗体及炎性物质通过相互调节、相互影响直接或者间接参与RA的发生和发展过程[9]。其中IL-17是一种由Th17细胞所分泌的促炎细胞因子，可诱导黏附分子、蛋白酶以及其他细胞因子的产生，在RA的发生和发展过程中发挥作用[10]。RF是一种抗人IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体，最初于1984年在RA患者血清中被发现。CRP是一种由肝细胞所合成，具有激活补体和促进粒细胞及巨噬细胞的吞噬作用的急性时相反应蛋白，在急性创伤和感染时其浓度急剧升高。有关研究表明，IL-17、RF及CRP浓度在RA患者血清中明显升高。本研究结果显示，RA组血清中IL-17，RF及CRP浓度明显高于对照组健康人群，差异有统计学意义(P<0.05)，与国内外有关研究结论一致[5,6,8,11]，说明了IL-17，RF及CRP与RA疾病的发生和发展具有一定的相关性，对RA的诊断、疗效判断具有一定的参考价值。

目前为止，RA的病因仍不清楚，可能与环境、免疫及遗传因素等有关，其中约50%的RA发病与遗传基因易感性有关[12，13]。至今为止，已发现40多个与RA相关的SNP位点，IL-17F基因为其中之一[14]。IL-17F是由Th17细胞分泌的一种促炎因子，可诱导多种细胞因子和趋化因子的表达，从而加剧滑膜的炎症反应及骨质的破坏[15]。近年来，有关研究发现IL-17F基因多个位点上存在基因突变，但不同地区和人群的遗传背景、生活习惯及环境等因素的不同而导致SNP的基因多态性分布存在很大差异性，如有关文献报道IL-17F基因某些突变与RA发病存在密切关系[7，9]，而另外有些研究却未发现IL-17F基因多态性与RA易感性相关[10，16]。本研究结果显示，深圳地区RA患者IL-17F基因位点rs763780 CC基因型及C等位基因检出率明显高于健康人群，差异有统计学意义(P<0.05)，与国内外部分文献研究的结论相一致[7，9]，这可能与IL-17F基因位点rs763780 CC基因型及C等位基因是导致本地区RA发病的遗传易感基因等有关，且CC基因型突变RA患者血清中IL-17浓度明显高于其他基因突变类型的RA患者，差异有统计学意义(P<0.05)，而RF和CRP浓度改变与IL-17F基因位点rs763780基因型突变类型无关联性，这可能与CC基因型突变仅影响到了IL-17的表达并改变细胞因子的结构等有关[14，17]，具体机制有待进一步研究。

综上所述，RA发病机制十分复杂，IL-17、RF及CRP在RA患者血清中明显升高，同时IL-17F基因位点rs763780的SNP多态性分布与RA的发生和发展有密切相关性，且不同地区、不同人群因遗传背景和生活环境因素的不同而存在很大差别。因此，加强不同地区、不同人群RA易感基因SNP多态性调查分析有助于RA的发病机制阐明，并为RA的诊断、治疗和预后判断提供有效的遗传标志物。