四株乳酸菌及其组合抑菌效果比较

■白天天 普宣宣 蒋辰宇 王 彦 郭雪峰，2* 席琳乔，2

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔843300）

养殖畜牧业为了促进动物生长发育，提高胴体重，减少发病率，获得收益，大量抗生素投入生产中。据悉每年用在动物预防与治疗的药品可达上万元，用于促进动物生长发育的药品也不容小觑[1]。养殖畜牧业对抗生素使用，致使抗生素沉积，产生耐药性和人畜共患病。长此以往，将会出现无法医治的情况[2]。人们从动植物资源中分离出乳酸菌制剂等天然抗菌剂可代替抗生素添加至饲料中，不但具有较强的抑菌作用，促进动物消化吸收[3]，而且无副作用。且乳酸菌为人畜体内常见的益生菌，具有改善胃肠道环境，调节菌群结构，促进动物消化吸收，提高免疫力等的功能[4]，由于其较为明显的抑菌效果[5-9]，乳酸菌可添加进食品中，用于食品发酵如酸奶，起到改善食品风味延长保质期和货架期的作用[10-11]，乳酸菌在肠道内属优势菌群, 可以屏蔽一些有害菌种的侵袭，抑制致病菌和腐败菌的生长繁殖，保障肠道内微生态平衡[12]。乳酸菌产生乳酸从而起到抑菌的作用[13]。本试验旨在从青贮中分离出来的乳酸菌对饲料中常见致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌的抑制效果进行比较，为筛选优良的乳酸菌添加剂提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种来源

本研究所用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌为塔里木大学新疆建设兵团畜牧科技重点实验室冷冻保存的菌种，在4 ℃条件下，在斜面半固体肉汤培养基中接种保存的菌种进行活化，将菌种在37 ℃恒温培养箱中培养24 h备用。

本研究所用乳酸菌W和B、L及SW分别从新疆本地梨子青贮、苹果青贮、无花果叶青贮中分离得到。于4 ℃条件下，由塔里木大学畜牧科技重点实验室保存备用。

1.1.2 培养基

乳酸菌培养使用添加2 g/l碳酸钙的MRS固体培养基，指示菌的筛选及培养使用肉汤培养基。肉汤培养基测定pH 值为7.4～7.6 后需要过滤，使用0.3 mol/l氢氧化钠滴定。

1.1.3 试剂与仪器

主要试剂：细菌DNA基因组提取试剂盒（天根深化科技有限公司）、琼脂糖、50%TBE溶液。

主要仪器：pH计（PHSJ-5，上海仪电科学仪器有限公司），霉菌培养箱（MJX-160，宁波江南仪器厂），超净工作台（SW-J-2FD，上海博迅实业有限公司），高压灭菌锅（SX-500，上海法润科学仪器有限公司），电子天平（XP603S，瑞士梅特勒-托利多中国公司），电热恒温培养箱（DNP9162，上海精宏实验设备有限公司），超低温冰箱（DW-86L286，海尔集团公司），全温型恒温培养摇床（TY-R70，天津市泰斯特仪器有限公司），优普系列超纯水器（UP-11-10T，四川优普超纯科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌菌液的制备

何宝宏，毕业于中国科学院计算技术研究所，获计算机博士学位，目前担任中国信息通信研究院云计算与大数据研究所所长；从事互联网研究20余年，现主要研究方向为互联网技术哲学；出版《互联网的基因》等书。

将实验室筛选保存的乳酸菌菌种W、L、B、SW划线于MRS斜面培养基中在30 ℃恒温培养箱中无氧培养24 h，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中后在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，涡旋振荡1 200 r/min，备用。

1.2.2 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌菌液的制备

将实验室接种在半固体肉汤斜面培养基表面保存备用的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌取出，在超净工作台中用接种环刮取部分在20 ml液体肉汤培养基中30 ℃电热恒温培养箱中培养24～36 h 至大量菌株产生，备用。

将实验室接种在半固体肉汤斜面培养基表面保存备用的黄曲霉菌取出，在超净工作台中用接种环刮取部分在20 ml 液体肉汤培养基中28 ℃霉菌培养箱恒温培养24～36 h至大量菌株产生，备用。

1.2.3 四种乳酸菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌的抑菌效果比较

采用双层平板法比较W、L、B、SW对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌的抑制效果。首先将MRS固体培养基倒入培养皿中作为下层平板，均匀铺平，凝固后沾取活化备用的乳酸菌菌液在MRS平板上划2条2～3 m的平行直线，于37 ℃电热恒温培养箱中无氧培养24～36 h至长出菌苔。后将1 ml活化备用的致病菌菌液与半固体肉汤培养基混合均匀后取5 ml移入培养皿中，均匀覆盖在含有乳酸菌菌苔的培养基上，在28 ℃霉菌培养箱中培养48～72 h，检测乳酸菌生长条带周围是否出现抑菌圈。同时，本试验依据单菌株抑菌效果将抑菌效果一般的W和L组合，效果较好与效果较差的B和SW组合，同时将SW作为对照进行组合抑菌，检测组合后的抑菌效果并与效果最好的单菌株进行对比。将W和L，B和SW在MRS平板上分别划一条2～3 m的平行直线后接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌进行抑菌试验，从而比较W、L、B和SW对指示菌的抑菌效果。

1.2.4 提取细菌DNA及序列分析

2 结果与分析

2.1 单菌液对指示菌的抑菌效果比较

表1 单菌液对指示菌的抑菌直径比较(mm)

由表1 可知，抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黄曲霉菌效果最好的菌株为SW，抑菌直径分别为（47.89±0.10）、（40.24±0.11）、（42.54±0.12）mm；其次L对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，抑菌直径分别为（35.48±0.05）、(35.95±0.16) mm；W对黄曲霉菌的抑菌效果较好，抑菌直径为(39.90±0.03) mm。说明本研究中乳酸菌均对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黄曲霉菌有抑菌作用，SW 抑菌效果最好。表1 可见SW 的抑菌效果最好，故以SW 对指示菌的抑菌大小为例，即图1。

图1 SW菌株对部分指示菌抑菌直径的大小

2.2 组合菌液对指示菌的抑菌效果比较

表2 组合菌液对指示菌的抑菌直径比较（mm）

由表2 可知，在组合菌株中，抑制大肠杆菌效果最好的菌株为W+L，抑菌直径为(40.06±0.13) mm。对金黄色葡萄球菌和黄曲霉菌抑菌效果最显著的是B+SW，抑菌直径分别为(35.50±0.12) mm 和(34.00±0.15) mm；SW对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黄曲霉菌的抑菌直径分别为(47.89±0.10)、(40.24±0.11)、(42.54±0.12) mm。说明本研究中乳酸菌组合均对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黄曲霉菌有抑菌作用。但SW 对致病菌的抑菌效果比W+L 和B+SW 的组合抑菌效果好。从表2 可见，组合菌株中，W+L 对大肠杆菌的抑菌效果最好，B+SW 对金黄色葡萄球菌和黄曲霉菌的抑菌效果最好，故以W+L 对大肠杆菌、B+SW 对金黄色葡萄球菌和黄曲霉菌的抑菌效果为例，见图2。

图2 乳酸菌组合菌液对部分指示菌抑菌直径的大小

2.3 乳酸菌基因组DNA凝胶电泳

4 株菌的基因组DNA OD260nm/OD280nm基本位于1.8～2.0 的范围内，由图3 可知，各菌株基因组DNA 凝胶电泳在目标位置处均有亮带，证明该DNA 提取方法具有可行性。

2.4 16S rDNA序列分析鉴定结果

通过抑菌实验筛选出W、L、B、SW 共4 株对指示菌具有抑菌作用的菌株；采用有抑菌活性的乳酸菌菌株的16S rDNA 的PCR 产物测序，通过同源性分析的方法，确定了菌株的分类(见图4)；结果表明，菌株W与蒙氏肠球菌的相似性为99%，菌株L与鹑鸡肠球菌的相似性为99%，菌株B与溶血性葡萄球菌的相似性为99%，菌株SW 与屎肠球菌的相似性均为99%。根据系统发育树最后确定菌株W为蒙氏肠球菌（Enterococcusmundtii），L为鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)，B 为溶血性葡萄球菌(Staphylococcushominis)，SW为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)。

图3 乳酸菌DNA提取产物琼脂糖凝胶电泳图

3 讨论

近年来，我国对乳酸菌抑菌作用的研究越来越多，帕提古丽·毛拉红等[14]发现乳酸菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黄曲霉菌具有抑制作用；有人从动物体内分离出对大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、一些腐败菌假单胞菌和希瓦氏菌都有很好的抑制效果的乳酸菌[15-16]；王志新等[17]从东北酸菜中筛选到发现一株对常见的食源性致病菌和腐败菌具有较强抑菌作用的植物乳杆菌；Li等[18]从多种泡菜中发现了产苯乳酸的植物乳杆菌；韩立英等[19]发现在青贮中添加乳酸菌对腐败菌具有抑制作用。国外对乳酸菌的研究也很多，美国、日本及欧洲等国已经对青贮用乳酸菌进行了大量的研究并取得了一定的成果[20]。日本人在很早的时候对乳酸菌进行应用，日本农林水产省草地实验场调制贮藏研究室的蔡义民等[21]研究认为乳酸菌对玉米秸秆青贮饲料的发酵中产生的致病菌腐败菌具有抑菌作用；2009年Valerio等[22]从小麦生态系统中分离得到一株乳酸菌并发现其具有抗真菌活性的作用。国内外的科学家们密切关注着乳酸菌的生理优势，并进行深入研究，为乳酸菌是否具有抑菌作用提供了理论支撑，为成功筛选具有抑菌活性的乳酸菌提供参考价值。

图4 四株乳酸菌基于16S rDNA的系统发育树

人们对屎肠球菌抑菌作用的研究较多[23-26]，屎肠球菌对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌等多种致病菌有较好的抑菌活性。王晓蕊[27]从健康仔猪体内分离出1 株能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的屎肠球菌，这与本实验结果一致。在本试验中除无花果叶青贮中分离出的屎肠球菌对三种指示菌抑菌作用最好外，苹果青贮中分离出的鹑鸡肠球菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，梨子青贮中分离出的蒙氏肠球菌的对黄曲霉菌的抑菌效果较好，组合后发现大肠杆菌抑菌效果最好。李莉媛[28]发现鹑鸡肠球菌和屎肠球菌均对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，与本试验结果一致，但现在暂无鹑鸡肠球菌对黄曲霉菌抑菌作用的研究。有研究发现蒙氏肠球菌对单核细胞增生李斯特菌具有抑菌作用[29]。刘晗璐[30]从披碱草和老芒麦鲜牧草中分离出蒙氏肠球菌，与植物乳杆菌组合添加至青贮中，能有效抑制霉菌生长。在本试验中蒙氏肠球菌和鹑鸡肠球菌分别对黄曲霉菌和大肠杆菌抑制效果较好，组合后对大肠杆菌抑菌效果最好。而溶血性葡萄球菌的抑菌研究较少，多为耐药、耐抗生素机理[31]，在本研究中发现溶血性葡萄球菌对指示菌的抑菌作用一般，无花果叶青贮中分离出来的屎肠球菌对三种指示菌抑菌效果都较好，组合后对指示菌抑菌作用比屎肠球菌单菌液的抑菌效果差。乳酸菌菌种组合后出现对某些致病菌的抑制效果加强或减弱，可能是因为菌种之间出现了协同和相互抑制作用，导致抑菌机制发生改变，出现这种结果的具体原因还有待研究。

4 结论

本研究结果表明，W、L、B 和SW 均对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌具有抑菌作用，通过16S rDNA序列分析鉴定，得到了四种乳酸菌，分别为蒙氏肠球菌（Enterococcusmundtii），鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)，溶血性葡萄球菌(Staphylococcus hominis)和屎肠球菌(Enterococcusfaecium)。在单菌株中，从无花果叶青贮中分离得到的屎肠球菌对三种指示菌的抑菌效果最好，将4种乳酸菌组合后发现对大肠杆菌抑菌效果最显著的是为蒙氏肠球菌和鹑鸡肠球菌，对金黄色葡萄球菌和黄曲霉菌抑菌效果较好的是溶血性葡萄球菌和屎肠球菌组合，屎肠球菌单菌株的抑菌效果优于组合菌液的抑菌效果。