籽瓜多糖提取工艺的响应面优化及其体外降血脂活性

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(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830000; 2.新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所,新疆乌鲁木齐 830000)

近些年来,心脑血管疾病已成为危害人类健康最严重的疾病之一,发病率呈逐年上升的趋势,血脂浓度升高会增加心脑血管疾病患者的死亡率。通过饮食方式降低血脂浓度,预防心脑血管疾病的发生,引起了人们的广泛关注[1-3]。因此,更为健康的天然物质的活性成分已经成为研究的热点之一。已有研究证实,多糖的降血脂作用温和,毒副作用小,对高脂血症人群具有良好功效[4]。

多糖是由10个以上单糖分子通过糖苷键连接形成的天然高分子化合物,具有调节机体免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、抗癌、抗菌、防辐射和降糖脂等生理活性[5-9]。多糖来源和提取方式的不同,其功能功效也有所不同。目前,对多糖的提取方法主要有溶剂提取法[10]、超声辅助法[11]、微波辅助提取法[12]和酶提取法[13]等。与其它方法相比,超声辅助法具有强烈的空化效应,增加溶剂穿透力,加快多糖溶出速度,既能提高提取率,又不破坏其生物活性。

籽瓜(Citrulluslanatussp.Convarvar.MegulaspemusL.),又名打瓜,主要分布于我国新疆、甘肃、东北及内蒙古东部等地区[14]。籽瓜是新疆重要的经济作物之一,在农业产业结构调整中占有重要地位,种植面积有21万公顷,产量已达30万吨[15]。籽瓜主要是以取籽加工为主,瓜皮瓜瓤丢弃在田间,造成巨大的资源浪费和环境污染。籽瓜取籽加工后的副产物籽瓜汁、籽瓜瓤和籽瓜瓜皮的再利用,不仅能提高籽瓜的经济价值,还能减少环境污染。如何提高籽瓜加工副产物的综合利用率,增加附加值降低生产成本,是决定籽瓜加工业进一步提升的一个重要环节。因此,需要对籽瓜有益成分的提取和加工进行深入研究,评价籽瓜皮渣中有益成分的功能。籽瓜加工副产物中含有多糖、果胶、维生素、氨基酸等多种营养物质,其中籽瓜多糖的研究主要集中在抗氧化生物活性方面[16],降血脂活性的研究却鲜有报道。研究籽瓜中的多糖降血脂活性,验证籽瓜多糖的食药作用是提高籽瓜加工副产物利用率的研究方向之一。

本文以新疆籽瓜为试材,优化籽瓜多糖超声辅助的提取工艺,分析考察籽瓜多糖的降血脂作用,并与其他提取物的胆酸盐结合试验结果作比较,探讨籽瓜多糖的降血脂效果,为籽瓜副产物精深加工和多糖的降血脂功效的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

籽瓜 2018年8月采摘于新疆昌吉籽瓜种植园;石油醚、无水乙醇、氢氧化钠、硫酸、盐酸 天津市北联精细化学品开发有限公司;胃蛋白酶(1∶3000)、胰蛋白酶(1∶250)、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠 上海源叶生物科技有限公司。

KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;LGJ-25C冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司;RE100-Pro旋转蒸发仪 美国SCILOGEX公司;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;0DD150FL高效热泵除湿干燥机 广州晟启能源设备有限公司;Centrifuge 5810R大容量离心机 艾本德公司;ML204/2电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;UV-2600型紫外-可见分光光度计 岛津企业管理(中国)有限公司;THZ-98AB恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 籽瓜干粉的制备 将籽瓜原材料去翠衣皮,切块,去籽,留瓜瓤,经40 ℃低温干燥48 h后粉碎,经100目筛网过滤得到籽瓜干粉。将籽瓜干粉按原料∶石油醚=1∶3 (W/V)的比例加入石油醚原液,室温条件下浸泡12 h后,采用旋转蒸发仪浓缩体积,回收石油醚。重复2次,除去脂溶性杂质,最后放入40 ℃烘箱内干燥,得到籽瓜干粉原料。

1.2.2 籽瓜多糖的提取工艺 参照文献[17-19]的方法,略作修改。取1 g处理后的原料,以蒸馏水为溶剂,采用超声波辅助提取。在实验设定的温度、时间、超声功率等条件下提取籽瓜多糖。提取液于转速为10000 r/min离心10 min,取上层清液于50 ℃旋转蒸发仪中减压浓缩至一定体积,加入4倍无水乙醇20 mL,醇沉24 h。8000 r/min离心10 min,取下层沉淀(白色絮状物质),用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤2～3次,Sevag法(正丁醇∶氯仿=1∶4)脱去蛋白,-60 ℃冷冻干燥得到籽瓜粗多糖。苯酚-硫酸法测定多糖含量,多糖得率计算公式如(1)式:

式(1)

1.2.3 籽瓜多糖提取单因素实验

1.2.3.1 提取温度对籽瓜多糖得率率的影响 固定超声功率为500 W,以料液比为1∶30 g/mL,提取温度分别为20、30、40、50、60 ℃的条件下提取2 h。平行提取3次,考察提取温度对多糖得率的影响。

1.2.3.2 提取时间对籽瓜多糖得率的影响 以料液比为1∶30 g/mL,超声功率为500 W、提取温度为40 ℃的条件下,分别提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。平行提取3次,考察提取时间对多糖得率的影响。

1.2.3.3 料液比对籽瓜多糖得率的影响 以超声功率为500 W,提取温度为40 ℃,料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL的条件下提取2 h。平行提取3次,考察料液比对多糖得率的影响。

1.2.3.4 超声功率对籽瓜多糖得率的影响 以料液比1∶30 g/mL,提取温度为40 ℃,超声功率分别为100、200、300、400、500 W的条件下提取2 h。平行提取3次,考察超声功率对多糖得率的影响。

1.2.4 响应面优化试验 在单因素优化试验的基础上以最优提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)、和超声功率(D)为自变量,根据Box-Behnken设计原理[19],进行四因素三水平的响应面分析试验。以籽瓜粗多糖得率为响应值,优化籽瓜多糖的提取工艺参数。因素水平设计见表1。

表1 Box-Behnken实验设计因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.2.5 体外降血脂作用的研究

1.2.5.1 胆酸盐标准曲线的绘制 参照文献[20]的方法,略作修改,分别绘制甘氨胆酸盐和牛磺胆酸盐标准曲线。配制甘氨胆酸钠标准溶液0、0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L,和牛磺胆酸钠标准溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L。取不同浓度的标准溶液2 mL分别置于不同具塞试管中,每只试管加入6 mL质量分数60%的H2SO4溶液。之后于70 ℃水浴加热20 min,取出放置冰浴5 min,在波长为387 nm处测定吸光度。以胆酸盐浓度为横坐标,吸光度为纵坐标分别绘制甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠标准曲线图。

1.2.5.2 胆酸盐结合实验 参照文献[20]的方法,略作修改。分别移取3 mL质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL籽瓜多糖溶液两份于100 mL三角瓶中,每个三角瓶分别加入3 mL 10 mg/mL胃蛋白酶溶液和1 mL 0.01 mol/L的HCl溶液,在37 ℃的恒温振荡器内振荡1 h(模拟胃消化环境),0.1 mol/L的NaOH溶液调节pH至6.3。随后,加入4 mL 10 mg/mL胰蛋白酶溶液,37 ℃下恒温振荡器振荡1 h(模拟肠道环境)。一份样品三角瓶中加入4 mL 0.4 mmol/L甘氨胆酸钠;另一份样品三角瓶中加入4 mL 0.5 mmol/L牛磺胆酸盐。在37 ℃的恒温振荡器内振荡1 h,于4000 r/min离心20 min,取上清液,用比色法于387 nm处测定吸光度值,每个样品平行测定3次,按照标准曲线计算剩余甘氨胆酸盐和牛磺胆酸盐含量,所加入甘氨胆酸盐或牛磺胆酸盐总量减去剩余量所得差值与总量的比值即为结合率,以百分比表示。计算公式如(2)(3)式:

式(2)

式中:c0为甘氨胆酸钠加入量,μmol;c1为甘氨胆酸钠剩余量,μmol。

式(3)

式中:c2为牛磺胆酸钠加入量,μmol;c3为牛磺胆酸钠剩余量,μmol。

1.3 数据处理

采用Excel 2010作图表。使用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度对籽瓜多糖得率的影响 由图1a可知,温度对于籽瓜多糖的得率有着显著(P<0.05)的影响。随着温度的上升,籽瓜多糖得率呈现先增加后下降的趋势,当温度为30～40 ℃时,籽瓜多糖得率随温度的上升，增加的趋势最迅速,多糖得率在40 ℃时达到最大值,在一定范围内,提取温度的升高,有利于分子的运动和多糖的溶出;温度过高则会影响到多糖的结构,会使多糖得率降低。因此选择的最佳提取温度为40 ℃。

2.1.2 提取时间对籽瓜多糖得率的影响 由图1b可知,随着提取时间的增加,籽瓜多糖的得率先升高后下降,在2.0 h时达到最大值。由于超声波的空化效应增大,溶剂进入溶质内部的能力增强,较短时间内,超声开始对细胞进行破碎,使得多糖更容易从细胞中释放出来,使得整个提取时间缩短,得率增大。随超声时间的增长,多糖分子中的五碳环或六碳环可能裂解成为可溶于乙醇的寡糖、低聚糖或单糖,造成多糖在醇沉过程中溶解损失增加;此外,超声波空化效应作用力减小,会影响多糖溶出。这些因素都会导致多糖得率的下降[21-22]。比较分析消耗能量、浸提时间和原料浪费等各种因素,选择的提取时间为2.0 h。

2.1.3 料液比对籽瓜多糖得率的影响 由图1c可知,多糖得率随料液比的增大呈现先上升后下降的趋势，在料液比为1∶30 g/mL时，多糖得率最大。这可能是溶剂体积的增加使得溶液中多糖浓度下降,多糖分子扩散的压力差增大,有利于多糖分子的扩散和溶出。当多糖的扩散量达到一定的值时,继续加大溶剂比例,也不会使更多多糖扩散[23]。并且料液比增大,可能会致使后续的提取浓缩过程中随时间增加,多糖损失升高,导致多糖得率下降。因此,选择料液比为1∶30 g/mL。

2.1.4 超声功率对籽瓜多糖得率的影响 由图1d可知,多糖得率的变化随着超声波功率的增大呈现先增加后缓慢降低至平稳的趋势。当提取功率为200 W时多糖得率最大,随着超声功率的继续增加,多糖得率基本保持不变。这是因为随超声功率增大，超声的空化作用随之加强,细胞破裂多糖加速溶出;当超声波功率增大到一定值时,多糖得率不会再增加基本保持不变[24]。因此,选择适宜超声波功率为200 W。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果及方差分析 通过单因素实验发现:在提取过程中提取温度为40 ℃,提取时间为2.0 h,料液比为1∶30 g/mL,超声功率为200 W时,籽瓜粗多糖得率最大。如表2所示,将提取温度、提取时间、料液比和超声功率作为研究的对象,籽瓜粗多糖得率为响应值,共得到29个实验点,利用Design-Expert 10.0软件对数据进行多元回归拟合,确定籽瓜粗多糖得率对以上因素的二次多项回归模型为:

Y=5.98+0.17A+0.26B+0.45C+0.45D-0.017AB-0.12AC-0.12AD-0.010BC-5.000E-003BD-0.03CD-0.51A2-0.21B2-1.79C2-0.089D2

图1 提取温度(a)、提取时间(b)、料液比(c)和超声功率(d)对多糖得率的影响Fig.1 Effects of extraction temperature(a),extract times(b),ratios of material to water(c)and ultrasonic power(d)on the yield of polysaccharide

表2 籽瓜粗多糖提取响应分析方案及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

采用超声辅助提取籽瓜多糖的回归数学模型进行方差分析,检验方程的有效性和各因子的偏回归系数,回归模型的方差分析如表3所示。通过统计学分析可知,该试验选用的模型极显著(P<0.0001),方差的失拟项不显著(P=0.0559>0.05),所选模型的R2为0.9950,说明模型的选择是合适的,可用于超声辅助提取籽瓜多糖的分析与预测。同时,表3结果还显示,在本试验设计中:A、C项为高度显著(P<0.0001),AC、AD项为显著项(P<0.05),A2、B2、C2项均为高度显著项(P<0.0001),D2项为显著项(P<0.05)。

表3 次多项式回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance the regression model

注:*表示P<0.05,差异显著;**表示P<0.01,差异极显著;***表示P<0.001,差异高度显著。

2.2.2 响应面分析 如图2所示,由曲面的分析可预测、检验确定变量和响应值之间的相互关系,响应面越陡峭,表现出各个因素之间的两两交互作用越显著[25-26]。提取温度和料液比交互作用显著。

图2 各因素交互作用的响应面Fig.2 Response surface of interaction of various factors

2.2.3 最佳提取工艺验证 根据响应面结果,得到的最佳提取工艺条件是:提取温度为41.318 ℃、提取时间为2.039 h、料液比为1∶30.078 g/mL、超声功率为216.750 W。考虑到实际情况对上述条件加以修正,最终的优化条件为提取温度为42 ℃、提取时间为2 h、料液比为1∶30 g/mL、超声功率为220 W,在该参数下,进行3组平行实验,所得多糖得率平均值为6.03%,与理论预测值的6.024%相近,说明该回归方程能较准确反应各因素对籽瓜多糖提取率的影响,证明采用响应面法优化籽瓜多糖提取率回归模型可行。

2.3 籽瓜多糖体外降血脂能力分析

2.3.1 甘氨胆酸盐和牛磺胆酸盐标准曲线 由图3a和图3b可知:甘氨胆酸盐标准曲线回归方程为:y=2.8655x+0.0212,R2=0.9991,线性关系良好;牛磺胆酸盐标准曲线回归方程为:y=2.4664x+0.0126,R2=0.9990,线性关系良好。

图3 胆酸盐标准曲线(a)与牛磺胆酸盐标准曲线(b)Fig.3 Tandard curve of glycine sodium cholate(a) and taurine sodium cholate(b)

2.3.2 籽瓜多糖对胆酸盐的结合能力 从图4可以看出,籽瓜多糖与牛磺胆酸钠的结合量比与甘氨胆酸钠的结合量多,即籽瓜多糖与牛磺胆酸盐的结合能力更强,并且与二者的结合量均随多糖浓度的增加而升高。当籽瓜多糖的浓度达到2.5 mg/mL时,籽瓜多糖和甘氨胆酸盐、牛磺胆酸盐的结合率分别达到62.67%和69.27%。证实籽瓜多糖具有较好的体外降血脂活性。随着继续增加籽瓜多糖的量,结合率的上升变得缓慢;当籽瓜多糖浓度达到3.5 mg/mL时,籽瓜多糖与甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的结合率分别达到66.17%和70.27%。但仅是籽瓜浓度为2.5 mg/mL时结合率的1.06倍和1.01倍。

图4 籽瓜多糖对胆酸盐结合能力Fig.4 Capacity of polysaccharide from seed melon to bind sodium cholate

粗多糖中较高的胆酸结合能力是由于糖蛋白与多糖形成复杂的结构,有利于结合胆酸[27]。籽瓜多糖的浓度为2.5 mg/mL时,与两种胆酸钠盐的结合率明显高于4 mg/mL的黑木耳多糖[28],也略高于3.5 mg/mL桑叶茯砖茶多糖[29]和4 mg/mL裙带菜孢子多糖[30]与两种胆酸钠盐的结合率。说明低浓度的籽瓜多糖有很好的体外降血脂活性,可作为具有潜在价值的降血脂保健食品原料。然而它与茶树花渣乙醇萃取物[31]相比较,两种胆酸钠盐的结合率却略低。籽瓜多糖是以籽瓜废弃的瓜瓤作为原材料,采用水作为溶剂,提取成本较低。因而选取籽瓜为原材料制备的籽瓜多糖,会大大降低成本,提高籽瓜加工附加值。

3 结论

本实验中筛选出最佳提取工艺条件为提取温度为42 ℃、提取时间为2 h、料液比为1∶30 g/mL、超声功率为220 W。经实验验证,3次平行实验求得平均得率为6.03%,与理论预测值较接近。

体外降血脂结果可以得出:当籽瓜多糖浓度达到2.5 mg/mL时,籽瓜多糖与甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的结合率分别达到62.67%和69.27%。与其他提取物和两种胆酸钠盐的结合率做对比,低浓度籽瓜多糖有很好的降血脂效果,可以作为一种植物源降血脂保健药物,这一发现为籽瓜资源的利用提供了新的研究思路,也为籽瓜在医药食品行业开发奠定一定的理论基础。