黄芪多糖对果蝇寿命和抗氧化作用的影响

(长治学院生物科学与技术系,山西长治 046011)

衰老是引起多种慢性疾病的主要原因之一。近年来,预防衰老逐渐成为人们关注的焦点,提高机体免疫力的保健食品和药品也应运而生。大量研究证明,中药多糖尤其是补益类多糖可提高机体免疫器官质量,增强动物机体免疫功能,且具有安全、无毒、无残留等优点,是一类优良的生物反应调节剂[1-2]。

中药黄芪(Astragalusmembranaceus),又名北芪、绵芪,为豆科多年生草本植物,有膜荚黄芪和内蒙黄芪两种。《神农本草经》中记载该药味甘,性微温,归脾肺经,具有益气固表、敛汗固脱、利水消肿之功效。研究表明黄芪中最主要的活性成分是黄芪多糖(Astragaluspolysaccharide),具有免疫调节、抗肿瘤、保护肠道、抗衰老等作用。舒迎霜等[3]研究表明黄芪多糖能显著提高犬血清中IgA、IgG、IgM和IFN-γ水平,促进犬小肠IgA mRNA和SIgA蛋自表达,提高机体免疫力。凌洪锋等[4]关于黄芪多糖对小鼠衰老模型的抗氧化作用研究表明,黄芪多糖有较好的抗氧化作用。黄芪多糖的抗氧化性主要通过清除DPPH、超氧阴离子、羟基自由基来实现[5]。清除自由基的抗氧化类食品可表现出不同程度的延缓衰老作用[6],陈敏[7]研究黄芪多糖对家蚕寿命的影响,结果表明黄芪多糖可延长家蚕寿命。

目前,关于黄芪多糖的抗氧化作用主要在禽畜中进行,试验周期长。果蝇(Drosophilamelanogaster)作为遗传学模式生物之一,具有与人类十分相似的病理结构、致病基因和衰老基因[8-9],因此常被用作寿命和抗衰老的生物模型[10-11]。但关于黄芪多糖对果蝇寿命的影响未见报道。因此,本文以果蝇为研究对象,用不同浓度黄芪多糖的培养基喂养,研究黄芪多糖对果蝇寿命和抗氧化酶活性的影响,以期为黄芪多糖的开发提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生型黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster),雄性成虫重(0.531±0.049) mg,雌性成虫重(0.714±0.052) mg 均由长治学院生物科学与技术系遗传学实验室提供;黄芪多糖(纯度UV≥90%)、超氧化物歧化酶(SOD)活力测定试剂盒(编号为A001-3)、总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒(编号为A015-1)、丙二醛(MDA)含量测定试剂盒(编号为A003-1) 北京索莱宝科技有限公司。

BSA 124S-CW 电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;SMZ-B2连续变倍体视显微镜 重庆澳浦光电技术有限公司;TGL-20M高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;723N可见光分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;Spectra Max M2多功能酶标仪 美谷分子仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 果蝇培养 果蝇基础培养基配方为玉米粉10%,白糖5%,酵母粉1.5%,琼脂1.5%,丙酸0.25%～0.4%。黄芪多糖培养基是在基础培养基中分别加1%(m/V)黄芪多糖母液1、5、10、15、20 mL,使其终浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL。每天光照培养12 h,温度为(25±1) ℃,湿度为40%～60%。

1.2.2 果蝇生存实验 收集刚羽化8 h内未交配的雌、雄果蝇各600只,分成6组,分别培养在不同浓度黄芪多糖(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL)的培养基中,每组5管,每管20只，对照组不加黄芪多糖。每6 d更换一次相应浓度的培养基,每天定时观察、记录统计死亡的果蝇数,非正常死亡的果蝇不计在内,直到最后一只果蝇死亡。对统计的结果进行整理,计算果蝇的半数死亡时间、平均寿命、最高寿命。每组最后存活的4只果蝇死亡天数的算术平均数作为最高寿命[12]。

1.2.3 果蝇逆重力爬行实验 取刚羽化8 h内的雌雄果蝇各6组,每组3管,每管20只。每 6 d更换一次相应浓度的培养基,培养30 d后,将果蝇转移至干净的指管中,轻拍指管使所有果蝇落至底部。统计1 min内爬过标记(距管底6 cm)的果蝇数量[13]。

1.2.4 果蝇抗氧化活性实验 取刚羽化8 h内未交配的雌、雄果蝇各6 组,分别培养在不同浓度的黄芪多糖培养基中,每组设3管重复,每管20只,每6 d更换一次相应浓度的培养基,将培养30 d的果蝇移入麻醉瓶中,用乙醚使其麻醉、分别称取20 mg雌、雄果蝇放入4 ℃预冷的研钵中,加入预冷的生理盐水100 μL,充分研磨后,经4 ℃,3500 r/min离心15 min,取上清液按照试剂盒步骤进行SOD、T-AOC活性及MDA含量的测定。其中,组织液中可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定,根据1%果蝇组织液适当稀释后于595 nm测定吸光值,绘制标准曲线y=0.0087x+0.011,R2=0.9934,计算组织液中蛋白质含量。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0进行统计分析,并用t 检验进行组间差异检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果均用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 黄芪多糖对果蝇寿命的影响

黄芪多糖对果蝇寿命的影响结果见表1。由表1可知,在试验浓度范围内,黄芪多糖对雌、雄果蝇的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命的影响呈先延长后缩短的趋势,均显著高于对照(P<0.05)。当黄芪多糖浓度为1.0 μg/mL时,雌、雄果蝇的半数死亡时间最长,分别比对照提高了52.09%和53.65%,黄芪多糖对提高雄果蝇半数死亡时间比雌果蝇高1.56%;另外,雌、雄果蝇的平均寿命最高,与对照相比,分别延长了27.69%和25.77%;最高寿命最长,分别比对照延长了16.71%和15.78%,黄芪多糖对延长雌果蝇平均寿命和最高寿命的影响分别高于雄性1.92%和0.93%。表明黄芪多糖可提高雌、雄果蝇的平均寿命,半数死亡时间和最高寿命。这与研究党参多糖[14]、山刺玫果多糖[15]和紫薯多糖[16]具有抗氧化性,延缓衰老结果相一致。最高寿命可以体现出果蝇对具有功能因子物质的适应性及耐受性[17]。本文研究结果表明黄芪多糖对雌、雄果蝇最高寿命的提高幅度不同,可能是由于雌、雄果蝇对受试药物黄芪多糖的适应性和敏感性不同造成,与丘婷等[18]研究六味地黄生物制剂多糖对果蝇抗氧化作用的影响的结果相一致。

表1 黄芪多糖对果蝇寿命的影响Table 1 Effects of Astragalus polysaccharide on life span of D. melanogaster

注:不同小写字母表示相同指标不同处理间差异显著(P<0.05),表2～表4同。

2.2 黄芪多糖对果蝇逆重力爬行能力的影响

黄芪多糖对果蝇逆重力爬行能力的影响见表2,由表2可知,随着黄芪多糖浓度的增加,雌、雄果蝇逆爬行能力呈先增加后下降趋势。当黄芪多糖浓度为1.0 μg/mL时,雌、雄果蝇的逆爬行能力最强分别为64.50%±3.03%和57.37%±3.39%,与对照相比差异显著(P<0.05),其中雌果蝇逆重力爬行能力增加了14.16%,雄果蝇逆重力爬行能力增加了27.97%。当黄芪多糖浓度为2.0 μg/mL时,与对照相比,雌果蝇逆重力爬行能力下降了11.77%,差异显著(P<0.05);雄果蝇逆重力爬行能力下降了2.28%,差异不显著。比较发现,同一浓度下,黄芪多糖对雄果蝇逆重力爬行能力增加量大于对雌性的影响,说明黄芪多糖可明显增强机体运动能力,且对雄果蝇逆重力爬行能力的作用较强。

表2 黄芪多糖对果蝇逆重力爬行能力的影响Table 2 Effects of Astragalus polysaccharide on the negative geotaxis ability of D. melanogaster

表3 黄芪多糖对果蝇SOD和T-AOC的影响Table 3 Effects of Astragalus polysaccharide on SOD and T-AOC contents of D. melanogaster

2.3 黄芪多糖对果蝇SOD和T-AOC的影响

表3是不同浓度黄芪多糖对果蝇超氧化物歧化酶SOD酶活性和T-AOC含量的测定结果。由表3可知,随着黄芪多糖浓度的逐渐增加,雌、雄果蝇体内SOD酶活性和T-AOC含量呈先增加后下降趋势,但均高于对照。当黄芪多糖的浓度为1.0 μg/mL时,雌果蝇体内SOD酶和T-AOC活性最高,为(172.54±1.62)和(209.4±2.35) U/mg prot,分别比对照提高了53.85%和59.03%;雄果蝇体内SOD酶和T-AOC活性最高,为(123.87±1.14)和(201.17±1.78) U/mg prot,分别比对照提高了56.52%和55.73%,差异极显著(P<0.05)。当黄芪多糖的浓度为2.0 μg/mL时,雌、雄果蝇体内SOD酶和T-AOC的活性虽高于对照,但与对照相比差异不显著(P>0.05)。

自由基学说是目前公认的衰老学说之一[19]。正常情况下,机体通过产生和清除自由基维持机体的正常生理功能,使生物体保持平衡[20]。但是当环境因素发生改变,就会诱导机体的抗氧化机制,保持自由基的产生与消除的平衡,对机体预防疾病与抗衰老等具有重要意义。总抗氧化物(T-AOC)是体内非酶促和酶促系统抗氧化物质的总和,可综合反映机体的抗氧化能力[21],SOD作为体内清除活性氧的主要抗氧化酶被认为是机体内自由基清除能力的间接评价指标[22]。表3中当黄芪多糖的浓度为1.0 μg/mL时,雌、雄果蝇体内SOD酶和T-AOC活性都最高,但是黄芪多糖对雄性果蝇SOD酶活性的提高幅度高于雌性2.67%,黄芪多糖对雌性果蝇T-AOC活性的提高幅度高于雄性3.3%。说明黄芪多糖可增强机体抗氧化能力,但是对雌果蝇体内的非酶促抗氧化能力T-AOC影响较大,对雄果蝇的酶促抗氧化能力SOD影响较大。张碧莹等[23]研究甘薯汁对果蝇寿命及抗氧化能力的影响,发现甘薯汁对提高雄蝇体内SOD活性表现出更强的作用,这与本文研究结果一致。

2.4 黄芪多糖对果蝇MDA的影响

表4是黄芪多糖对果蝇MDA的变化。由表4可知,随着黄芪多糖浓度的逐渐增加,雌雄果蝇体内MDA的含量呈先下降后上升趋势,但均低于对照。当黄芪多糖浓度为1.0 μg/mL时,雌、雄果蝇体内MDA的含量最低,为(0.65±0.03)和(0.87±0.02) nmol/mg prot,与对照相比,分别下降了38.68%和41.21%,且差异显著(P<0.05)。

MDA是自由基作用于不饱和脂肪酸而产生的脂质过氧化的产物,通常作为机体脂质过氧化程度的指标[24]。当黄芪多糖浓度为1.0 μg/mL时,雌、雄果蝇体内SOD和T-AOC抗氧化活性最强,MDA的含量最少,表明黄芪多糖可显著(P<0.05)增强机体抗氧化脂质程度。此时,雄性果蝇体内MDA含量的下降幅度高于雌性2.53%,说明黄芪多糖可显著降低雄果蝇机体脂质过氧化程度。

表4 黄芪多糖对果蝇MDA含量的影响Table 4 Effects of Astragalus polysaccharide on MDA content of D. melanogaster

3 结论

目前,关于黄芪多糖的抗氧化作用主要在禽畜中进行,试验周期长。因果蝇饲养容易,世代代周期短,易于操作,重复性好等优点,已在卫生部颁布的《保健食品功能学评价程序和检验方法》中被用作动物模型来研究抗衰老活性及动物抗衰老机制[25-26]。本文以果蝇为研究对象,研究黄芪多糖的抗氧化和抗衰老作用,结果表明,当黄芪多糖浓度为1.0 μg/mL时,可提高雌、雄果蝇的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命,增强果蝇的逆重力爬行能力,机体SOD酶活性和T-AOC含量含量最高,MDA含量最低。且该浓度下,黄芪多糖对提高雄果蝇的半数死亡时间,逆重力爬行能力,SOD酶活性和MDA的含量的影响均高于雌性,说明黄芪多糖可增强雄果蝇的体质,提高其抗氧化能力;但是对雌果蝇的平均寿命和最高寿命以及T-AOC含量的影响高于雄性,说明喂食雌、雄果蝇黄芪多糖时,在一定程度上激活雄果蝇机体的抗氧化机制抵御环境改变的能力强于雌果蝇,但是随着喂食时间和生活时间的延长,雌果蝇可持续发挥抗氧化机制延长其寿命强于雄果蝇。可能由于雌、雄果蝇体型大小不同,体质不同,所以影响的效果也不一样,还有待进一步研究。